Гмф это: чем они отличаются и как влияют на кожу?

Производство H ₂ O ₂ в качестве побочного продукта катализа было обнаружено с помощью каталазы (Sigma).Для этого 100 мкМ коричного спирта окисляли 0,2 мкМ HMFO. Когда уровень кислорода больше не снижался, добавляли 150 Ед каталазы для контроля повторного появления кислорода. Уровни кислорода контролировали с помощью сенсорных пятен REDFLASH и детектора и источника света Firesting O ₂ (Pyroscience, Ахен, Германия).

Идентификация продукта.

Продукты, образованные HMFO с HMF в качестве субстрата, анализировали с помощью колонки Zorbax Eclipse XDB-C8 (5 мкм; Agilent). В качестве подвижной фазы использовали 12 мМ фосфатный буфер при pH 7.0 (A) и ацетонитрил (B) использовали при скорости потока 1,2 мл мин. ^-1 . После 1 минуты 100% A, B увеличивалось до 5% за 3,5 минуты, а затем до 40% за 2,5 минуты. Через 0,5 мин 40% B элюент возвращался к 100% A за 0,5 мин, и этот уровень поддерживался в течение 2 мин. Детектирование проводили при 268 нм. Время удерживания HMF, DFF, HMF кислоты, FFA и FDCA составляло 6,4, 6,0, 1,6, 2,1 и 1,2 мин соответственно. Градуировочные кривые строили для растворов 0,1, 0,5, 1,0 и 2,0 мМ.

Образование продукта анализировали через 5 ч превращения 2 мМ HMF с помощью 5 мкМ HMFO (25 ° C, 600 об / мин).Реакционные смеси нагревали при 80 ° C в течение 5 минут для инактивации фермента, после чего агрегаты белка удаляли центрифугированием. В качестве отрицательного контроля растворы HMF, DFF, HMF кислоты и FFA обрабатывали таким же образом, но в отсутствие фермента для мониторинга спонтанного окисления субстрата и промежуточных продуктов воздухом.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Идентификация и клонирование гена, кодирующего HMFO.

Для более детального изучения HMF-окисляющего фермента C.basilensis , мы впервые попытались экспрессировать HmfH в E. coli . Для этого использовали несколько экспрессионных плазмид на основе pBAD и pET при тестировании различных штаммов E. coli , температур роста и концентраций индукторов. Помимо природного гена hmfH , в тесты на экспрессию были включены несколько генов с оптимизированной экспрессией. Однако не удалось достичь экспрессии растворимого HmfH, даже при использовании мальтозосвязывающего белка или SUMO в качестве партнера слияния для повышения экспрессии растворимого белка (результаты не показаны).Поэтому мы решили искать гомологичные гены, для которых соответствующие ферменты, как ожидается, будут выполнять аналогичную метаболическую роль. Поиск BLAST в базе данных последовательностей выявил несколько гомологов HmfH, все с неизвестными функциями. Ближайшие гомологи происходят в основном от видов Burkholderia (идентичность последовательностей от 32 до 69%), при этом были идентифицированы гены других бактерий. Мы решили продолжить с двумя гомологичными генами, одним из B. phytofirmans PsJN ({«type»: «entrez-protein», «attrs»: {«text»: «YP_001895804.1 «,» term_id «:» 187924162 «,» term_text «:» YP_001895804.1 «}} YP_001895804.1) и один из штамма MP688 Methylovorus sp. ({» Type «:» entrez-protein «,» attrs «: {» text «:» YP_004038556.1 «,» term_id «:» 313199898 «,» term_text «:» YP_004038556.1 «}} YP_004038556.1). Кодированные белки показали 69 и 46% идентичности последовательности с HmfH последовательность белка (см. фиг. S4 в дополнительном материале). Гены, кодирующие эти гомологи, были упорядочены как гены с оптимизированной экспрессией в векторе pJexpress 404. Подобно HmfH, белок из B.phytofirmans PsJN не может быть экспрессирован в E. coli . Гомолог Methylovorus может быть функционально экспрессирован. Поскольку экспрессия была ограничена этой конструкцией, была создана конструкция слияния pET-SUMO, что привело к 20-кратному увеличению экспрессии.

Структурные и спектральные свойства HMFO.

Из 1 литра культуры с OD ₆₀₀ , равным 20, можно было очистить 88 мг желтого SUMO-HMFO. Очищенный белок проходит в виде одной полосы с массой около 70 кДа на SDS-PAGE.Это согласуется с предсказанной массой 70,4 кДа слитого белка His ₆ -SUMO-HMFO. Когда гель SDS-PAGE был пропитан 5% уксусной кислотой, УФ-флуоресцентная полоса не могла быть обнаружена, что позволяет предположить, что кофактор флавина не связан ковалентно с белком. Близким гомологом с известной структурой является холиноксидаза (EC 1.1.3.17; CholO) из Arthrobacter globiformis (идентичность последовательностей 32%). В этом белке кофактор FAD ковалентно связан через 8-α-гистидильную связь.Попарное выравнивание последовательностей показывает, что соответствующий гистидин, ответственный за связь белок-FAD, His99, не консервативен в HMFO (Val101 в этом положении). Для проверки диссоциации кофактора флавина HMFO подвергали обработке трихлоруксусной кислотой и последующему центрифугированию. Это действительно привело к образованию белого осадка белка и желтого супернатанта.

Спектр УФ-видимого света нативного фермента представлял собой типичный спектр поглощения флавопротеинов с максимумами поглощения при 385 и 456 нм.После развертывания с помощью SDS был получен спектр флавина, который был идентичен спектру коммерчески доступного FAD с максимумом поглощения при 450 нм. Используя известную константу экстинкции для FAD (ε ₄₅₀ = 11,3 мМ ⁻¹ см ⁻¹ ), константа экстинкции для HMFO (ε ₄₅₆ = 10,7 мМ ⁻¹ см ⁻¹ ) может определяется ().

Спектры поглощения рекомбинантных HMFO дикого типа, SUMO-HMFO h567A и FAD.

Чтобы проверить, влияет ли слитый тег SUMO на свойства HMFO, N-концевую часть SUMO отщепляли протеолитической обработкой фермента слияния протеазой SUMO.Полученный рекомбинантный HMFO дикого типа сравнивали со слитым вариантом путем измерения их УФ-визуальных спектров, определения их стационарных кинетических параметров для HMF и измерения их термостабильности. Эти результаты показывают, что ни спектр флавина (свидетельствующий об идентичном микросреде вокруг кофактора флавина), ни активность HMFO (различия между значениями K _m и k _cat , <10%), ни его термостойкость (кажущиеся температуры плавления отличались <0.5 ° C), на него повлияло его сплавление с SUMO на N-конце. Поэтому мы решили использовать HMFO, конденсированный с помощью SUMO, для остальной части нашего исследования.

Субстратная специфичность HMFO.

HMFO был идентифицирован с помощью поиска BLASTp как гомолог (идентичность последовательности 46%) HmfH C. basilensis . Считается, что последний белок активен в отношении HMF. Следовательно, очищенный HMFO был проанализирован на активность с HMF. Фермент-зависимое снижение молекулярного кислорода показало, что HMFO активен в отношении HMF. Это соответствует предсказанию, что HMFO является членом семейства оксидаз GMC-типа.В большинстве оксидаз молекулярный кислород используется для повторного окисления кофактора флавина, что приводит к образованию H ₂ O ₂ . Для HMFO образование перекиси водорода было экспериментально подтверждено добавлением каталазы после инкубации HMFO и коричного спирта. Во время катализа расходуется 0,08 мМ молекулярного кислорода. Добавление 150 ед. Каталазы привело к образованию 0,04 мМ молекулярного кислорода, что свидетельствует о том, что HMFO является оксидазой.

Ферментативное окисление HMF представляет интерес для производства FDCA.Как показано на, это преобразование состоит из трех стадий окисления. Поэтому также измеряли активность HMFO в отношении промежуточных продуктов DFF, кислоты HMF и FFA. Неожиданно было обнаружено, что HMFO также превращает DFF и HMF кислоту. Несмотря на химическое родство, все эти фураны обладают разными свойствами. Это четко отражено в полученных значениях k _cat и K _m (). Сродство HMFO к HMF в 50 раз выше, чем к HMF-кислоте, возможно, из-за отрицательного заряда, вносимого карбоновой кислотой.Интригует активность HMFO в отношении DFF, альдегида. Окисление альдегидов не является обычным явлением для оксидаз GMC-типа. Было проанализировано несколько пар спирт-альдегид. Для DFF значение k _cat / K _m для DFF всего в семь раз ниже, чем для аналогичного спирта HMF-OH. Аналогичная спирто-альдегидная пара — фурфуриловый спирт и фурфурол. Кинетические параметры фурфурилового спирта сопоставимы с таковыми для HMF-OH. С другой стороны, фурфурол не является субстратом.

ТАБЛИЦА 1

Установившиеся кинетические параметры HMFO ^a

Мы обнаружили, что профиль приемлемости субстрата HMFO не ограничивается фуранами. Бензиловые спирты также легко усваиваются ферментом. Фактически, HMFO активен для всех протестированных первичных спиртов (как фуран, так и бензил). Значения k _cat для всех этих спиртов довольно похожи ().

Как и другие оксидоредуктазы GMC, HMFO, по-видимому, ограничен окислением углеродно-кислородной связи.Например, бензиламин амина не является субстратом, тогда как бензиловый спирт является. Кроме того, гидроксилирование двойной связи, осуществляемое FAD-содержащей оксидазой ванилилового спирта (19), не может осуществляться HMFO.

Идентификация продукта.

Чтобы установить идентичность продуктов, образующих HMFO, был проведен анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. После 5 ч инкубации 2 мМ HMF полностью конвертировали 5 мкМ HMFO (). Основным продуктом реакции была FFA (92%), но также присутствовало значительное количество FDCA (8%).В контрольной реакционной смеси без HMFO HMF оставался основным компонентом (> 99%), что означает, что HMFO необходим для превращения HMF. Чтобы исключить самопроизвольное окисление промежуточных продуктов (кислоты HMF, DFF и FFA) во времени, с этими производными HMF были приготовлены аналогичные контрольные реакционные смеси. Во всех случаях> 99% обнаруженных производных HMF были исходными соединениями. Это исключает спонтанное образование FDCA и подтверждает, что HMFO может продуцировать FDCA.

Производство продукции HMFO.Черные полосы представляют продукты, образованные 5 мкМ HMFO, начиная с 2 мМ HMF в качестве субстрата. HMF полностью превращается в FFA (92%) и FDCA (8%). В контрольном эксперименте без фермента (серые столбцы) HMF оставался. Присутствовали менее 0,5% кислоты HMF и FFA. Все эксперименты проводились в двух экземплярах, и средние значения показаны со стандартным отклонением в виде серых полос.

Оптимальная температура и pH HMFO.

Чтобы установить оптимальные условия для HMFO, были определены его pH и температурный оптимум.Активность определяли между pH 6,5 и pH 10 в буфере Бриттона-Робинсона. Оптимальный pH HMFO для активности был 8,0, и он сохранял почти 80% своей пиковой активности между pH 6,5 и pH 9,0. При pH 10,0 его активность снижалась до 30% (). Используемый буфер Бриттона-Робинсона снижает активность HMFO на 10% по сравнению с активностью, полученной с фосфатным буфером при pH 8,0.

(A) Оптимальный pH для активности HMFO. Показана активность HMFO в отношении 4-гидроксибензилового спирта, измеренная в буфере Бриттона-Робинсона.(B) Оптимальная температура (T) для активности HMFO на основе активности HMFO в отношении 4-гидроксибензилового спирта между 25 и 70 ° C. Максимальной активности при 55 ° C было присвоено значение 1.

Температурный оптимум был определен между 25 и 70 ° C. HMFO был наиболее активен при 55 ° C. При 25 ° C HMFO имел 60% активности, чем при 55 ° C, а при 70 ° C оставалось только 10% его активности (). Используя метод ThermoFAD, мы определили, что его кажущаяся температура плавления составляет 48,5 ° C. Это показывает, что оксидаза достаточно термотолерантна.

Идентификация активного центра гистидина, h567.

Одной из ключевых особенностей оксидаз GMC-типа является наличие абсолютно консервативного гистидина в С-концевом домене. Роль этого гистидина была исследована на хорошо изученных членах семейства GMC, таких как глюкозооксидаза, холиноксидаза (CholO) и оксидаза арилалкоголя (AAO) (13, 20, 21). Замена этого гистидина на аланин привела к резкому снижению катализа всех этих оксидаз. Модель гомологии HMFO была создана с использованием кристаллических структур пиранозоксидазы (3T37) и CholO (3NNE).Проверка этой модели показала, что h567 является гистидином активного центра в HMFO. Как и ожидалось, катализ HMFO h567A сильно снижен по сравнению с катализом фермента дикого типа. При использовании ванилилового спирта в качестве субстрата значение k _cat мутантного фермента в 4400 раз ниже, чем у фермента дикого типа. Однако это практически не влияет на сродство к субстрату (). Микроокружение флавина также изменяется в мутантном ферменте, как показывает спектр УФ-видимого света ().Максимум поглощения сместился с 456 до 464 нм (ε ₄₆₄ = 9,9 мМ ^-1 см ^-1 ). Понятно, что гистидин не играет важной роли в связывании субстрата, но необходим для катализа. Для HMFO еще предстоит определить, участвует ли h567 в окислительной или восстановительной полуреакции.

ОБСУЖДЕНИЕ

HMFO был идентифицирован как гомолог HmfH из C. basilensis (8). Считается, что последний белок активен в отношении HMF.Хотя он только на 45% идентичен HmfH и не имеет части длиной 35 аминокислот рядом с С-концом белка, HMFO также активен в отношении HMF. Однако профиль субстрата HMFO не ограничивается HMF. Многие другие фураны, а также бензильные соединения принимаются ферментом. Среди протестированных субстратов фермент проявляет активность в отношении всех ароматических соединений с метанольным заместителем. Это показывает, что помимо ароматичности важны положение и природа спирта. Эта строгая специфичность для первичных спиртов, вероятно, связана со специфической архитектурой активного сайта.Наиболее поддерживаемый механизм реакции для GMC-оксидаз включает отрыв протона от спиртовой группы в качестве начальной стадии катализа (22). Если заместитель более объемный, спиртовой фрагмент может быть расположен недостаточно близко, чтобы облегчить перенос гидрида на кофактор флавина. Альтернативно, затрудняется депротонирование спирта основанием активного центра.

Еще одним требованием является наличие в молекуле сопряженной системы, проиллюстрированной, например, циннамиловым спиртом и 2,4-гексадиен-1-олом.Плоская структура, обусловленная системой двойных связей, может быть требованием для продуктивного связывания субстрата. Альтернативно, сопряженная система расширяется, когда спирт окисляется до альдегида, и тем самым может способствовать окислению спирта.

Поскольку фермент не активен в отношении вторичных спиртов, мы не смогли продемонстрировать энантиоспецифичность для этой оксидазы. Это не означает, что фермент не является стереоспецифическим; он, скорее всего, будет абстрагировать гидрид предпочтительным стереоспецифическим образом.Атом C-α спиртовой части содержит два атома водорода, один из которых будет селективно отщепляться. Для Pleurotus eryngii AAO (23) с помощью монодетерированного p -метоксибензилового спирта было показано, что фермент извлекает только водород R, который наиболее близок к флавину N5, в виде гидрида. Будущие структурные и кинетические исследования покажут, действует ли HMFO по аналогичному механизму.

Скорости катализа на всех идентифицированных субстратах довольно похожи, независимо от заместителей в ароматическом кольце.Для пара -замещенных электронодонорных групп 4-аминобензилового спирта и 4-гидроксибензилового спирта были получены значения k _cat , аналогичные значениям, полученным с электроноакцепторным галогенидом, как в 4-хлорбензиловом спирте. . Все эти скорости сопоставимы со скоростями, полученными с незамещенным бензиловым спиртом. Однако заместители в кольце имеют большое значение для сродства HMFO к его субстрату. Отрицательно заряженная карбоновая кислота HMF-кислоты снижает ее аффинность в> 10 раз по сравнению с таковой для большинства незамещенных субстратов.С другой стороны, 4-хлорбензиловый спирт имеет значение K _m в 16 раз меньше, чем незамещенный бензиловый спирт.

Расслабленный профиль субстрата HMFO делает его интересным биокатализатором для окисления ароматических спиртов. Более того, HMFO не только окисляет широкий спектр ароматических спиртов, но также может окислять альдегиды. Окисление альдегидов не является общей чертой GMC-оксидаз. Заметным исключением является холиноксидаза (EC 1.1.3.17) (24), но для грибковых AAO (EC 1.1.3.7), также показано окисление альдегидов (15, 25). Для этих GMC оксидаз было показано, что гидратированный альдегид, gem -диол, является действительным субстратом. Как следствие, на реакционную способность альдегидов как субстратов сильно влияет природа заместителей в ароматическом кольце. Электроноакцепторные группы, такие как карбонильные заместители, как дезактивируют, так и активируют альдегид. Перенос гидрида затруднен, потому что электроны отводятся от альдегида. С другой стороны, альдегид легче гидратируется, когда присутствует электроноакцепторная группа.Таким образом, наличие большего количества субстрата в гидратированной форме может привести к более быстрому окислению (25). Из-за дезактивирующих и активирующих эффектов одного заместителя трудно предсказать, какой эффект будет иметь заместитель на катализ.

Для полного окисления HMF с образованием FDCA должны быть окислены как спиртовые, так и альдегидные группы. Анализ продукта показал, что FDCA образована HMFO. FFA был единственным наблюдаемым промежуточным продуктом, тогда как одиночные окисленные промежуточные продукты (HMF кислота и DFF) не были обнаружены ().Это иллюстрирует влияние активирующих или дезактивирующих групп на окисление альдегида, как описано выше. В FFA карбоновая кислота в положении 2 может препятствовать окислению альдегида в положении 5. Однако, когда фурановое кольцо содержит альдегидный заместитель (DFF) вместо карбоновой кислоты, реакционная способность увеличивается (). Образование FFA в качестве основного продукта согласуется со скоростями, указанными в, поскольку это единственный промежуточный продукт между HMF и FDCA, на котором катализ был плохим.

Профиль субстрата и способность окислять ароматические спирты и альдегиды обнаруживают поразительное сходство между HMFO и AAO грибов. Оба типа ферментов принадлежат к одному семейству флавопротеиноксидаз. Однако сходство последовательностей между этими оксидазами не указывает на сильную функциональную взаимосвязь (идентичность последовательностей <30%). Физиологические роли двух типов оксидаз также явно различаются. AAO секретируются грибами, чтобы способствовать разложению лигнина, в то время как бактериальный HMFO является внутриклеточным ферментом.Это запрещает прямую роль в деградации лигнина. Принимая во внимание сходство последовательности гена, кодирующего HMFO, с геном hmfH из C. basilensis , который участвует в деградации HMF, можно сделать вывод, что HMFO также является частью пути деградации HMF. Однако типичный кластер генов, обнаруженный у HMF-деградирующих бактерий (26), отсутствует у Methylovorus sp. штамм MP688.

Чтобы идентифицировать каталитически важные остатки в HMFO, модель гомологии HMFO была подготовлена ​​с использованием программного обеспечения YASARA (27).Наиболее изученным близким гомологом HMFO с известной кристаллической структурой является CholO. Сравнение модельной структуры HMFO со структурой CholO показывает, что несколько каталитически важных остатков CholO не консервативны. Отрицательно заряженный остаток Glu312 CholO, например, позиционирует положительно заряженный амин холина и, следовательно, не является консервативным, поскольку субстраты HMFO не содержат положительного заряда. Кроме того, холин не является субстратом для HMFO. Другие каталитически важные остатки, такие как His307, Val465 и His467 (His310, Val464 и His466 в CholO), являются консервативными.Для CholO было показано, что мутация гистидина в активном центре His466 в аланин снижает скорость реакции в 60 раз и увеличивает константу Михаэлиса в 17 раз (20). В нашем исследовании аналогичная мутация была введена в HMFO. Это привело к уменьшению в 4400 раз значения k _cat , тогда как значение K _m практически не изменилось, что подтверждает важность этого остатка для катализа. В исследованиях AAO из P. eryngii , His502 был заменен аланином, что привело к снижению значения k _cat почти в 3000 раз, аналогично эффекту, наблюдаемому в мутантном ферменте HMFO.Мутация также увеличила значение K _m в 80 раз, что намного серьезнее, чем эффект, наблюдаемый в HMFO (21). Исследования CholO и AAO из P. eryngii предполагают, что этот гистидин является основанием активного центра (28). Роль His467 в HMFO, вероятно, аналогична.

Идентификация и характеристика HMF-окисляющей оксидазы добавляет новый инструмент, с помощью которого можно разработать биокаталитический процесс для производства FDCA из HMF. HMFO — первый охарактеризованный фермент, способный окислять HMF и продуцировать FDCA.Кроме того, фермент может осуществлять селективное окисление многих бензильных субстратов. Профиль субстрата в значительной степени напоминает прием субстрата грибковых AAO. Было показано, что производство этих грибковых оксидаз в рекомбинантной форме затруднено. Следовательно, HMFO может также развиваться как биокаталитическая альтернатива этим оксидазам. В целом, HMFO является подходящим катализатором для применений, связанных с селективным окислением спирта и альдегида.

5-гидроксиметилфурфурол — обзор | Темы ScienceDirect

Платформа Furans

Превращение целлюлозы в фураны, 5-гидроксиметилфурфурол (HMF) и 2-фуральдегид (фурфурол) и его производные, универсальное сырье не только для производства полиэфиров и других пластмасс, но и дизельного топлива. как топливо и фармацевтические препараты (рис.6.8) — очень интересный процесс. Полисахариды могут быть гидролизованы до составляющих их мономеров, которые впоследствии могут быть дегидратированы протонной кислотой, а также кислотными катализаторами Льюиса (Zhao et al. , 2007; West et al. , 2008; Tong et al. , 2010; Lam et al., 2011) на фурановые соединения с карбонильной группой, такие как HMF, 5-метилфурфурол или фурфурол. Кроме того, фураны могут быть получены из фракций биомассы как целлюлозы, так и гемицеллюлозы; таким образом, фурановые платформы используют большую часть доступного лигноцеллюлозного сырья.

6,8. Реакции, участвующие в образовании HMF.

Фурфурол и HMF могут быть получены дегидратацией с хорошей селективностью (например, 90%) из ксилозы и фруктозы, соответственно, в двухфазных реакторах (Chheda et al. , 2007b), тогда как выходы ниже для глюкозы (42% при низкие концентрации 3 мас.%) (Martin Alonso et al. , 2010a). Добавление апротонных растворителей, таких как диметилсульфоксид (ДМСО) или N , N -диметилацетамид, улучшает селективность HMF из фруктозы с конечным выходом более 90% (Binder and Raines, 2009; Martin Alonso et al. al., 2010а). Снижение концентрации воды имеет решающее значение для селективного получения HMF, поскольку он легко гидратируется в воде с образованием левулиновой кислоты и муравьиной кислоты.

Чтобы свести к минимуму возникновение побочных реакций, таких как конденсация, соединения фурфурола можно экстрагировать из водного слоя с использованием органических растворителей (Роман-Лешков и др. , 2006; Chheda и др. , 2007a; West et al. др. , 2008), и добавлением солей к водной фазе (Роман-Лешков и др., 2007), что снижает растворимость органических веществ в воде. Использование ДМСО и экстрагирующего растворителя увеличивает селективность HMF до 55%, когда глюкоза используется в качестве корма, по сравнению с 11% в воде (Martin Alonso et al. , 2010a). Потенциальный недостаток этого подхода — использование растворителей; присутствие растворителей требует последующей стадии разделения, что увеличивает общую стоимость процесса; этот момент очень важен, когда используются растворители с высокой температурой кипения, такие как ДМСО.Энергетические потребности последующей очистки можно снизить, используя другие растворители, такие как 2-бутанол и метилизобутилкетон (MIBK) (Martin Alonso et al. , 2010a). Выход HMF может быть увеличен за счет комбинации хлоридов металлов и сильных кислот (HCl), особенно при преобразовании глюкозы, целлюлозы и лигноцеллюлозных материалов. Наилучшие результаты были получены при использовании CrCl ₂ в качестве катализатора (Zhao et al. , 2007; Tong et al. , 2010; Lima et al., 2011). Интересным вариантом является сочетание способности лигноцеллюлозных материалов растворять ионные жидкости и двухфазный реактор (Lima et al. , 2011; Wang et al. , 2011).

HMF может быть преобразован в жидкое топливо с использованием различных методов (рис. 6.9) (Kazi et al. , 2011; Jin and Enomoto, 2011). HMF может быть преобразован гидрогенолизом в 2,5-диметилфуран (ДМФ) с катализаторами на основе меди (Cu-Ru / C или CuCrO ₄ ) (Roman-Leshkov et al., 2007). ДМФ не растворяется в воде и может использоваться в качестве смесителя в транспортных топливах. Второй альтернативой является образование углеводородов, поскольку было показано, что различные карбонильные соединения, полученные из углеводов, такие как фурфурол, HMF, дигидроксиацетон, ацетон и тетрагидрофурфурол, могут конденсироваться в водных и органических растворителях с образованием более крупных молекул (C ₇ –C ₁₅ ), которые впоследствии могут быть преобразованы в компоненты дизельного топлива (Barrett et al. , 2006; Chheda and Dumesic, 2007).Для образования более крупных углеводородов HMF и другие продукты фурфурола могут быть улучшены путем альдольной конденсации с кетонами, такими как ацетон, над основными катализаторами (NaOH, MgO / ZrO ₂ ) или кислотными катализаторами (West et al. , 2008; Sádaba et al., 2011a, 2011b; Мурзин, Симакова, 2011). Однократная конденсация HMF и ацетона дает промежуточное соединение C9, которое может реагировать со второй молекулой HMF с образованием промежуточного соединения C15. Альдольная конденсация может сочетаться со стадиями гидрогенизации с использованием бифункционального катализатора, такого как Pd / MgO – ZrO ₂ , что приводит к высоким выходам продуктов конденсации (Chheda and Dumesic, 2007; Chheda et al., 2007а; Geboers et al. , 2011; Мартин Алонсо и др. , 2010а). Путем селективного гидрирования HMF и фурфурол можно превратить в 5-гидроксиметилтетрагидрофурфурол (HMTHDA) и тетрагидрофурфурол (THF2A), которые после стадий самоконденсации и гидрогенизации / дегидратации производят алканы C12 или C10 соответственно.

6.9. Схема перевода HMF на жидкое топливо.

Первое промышленное производство 5-HMF, первый жилой район на водородной основе, крупнейшая система топливных элементов, когда-либо существовавших на крупных кораблях, и многое другое: 10 лучших инноваций The Digest за неделю с 20 февраля: Biofuels Digest

Приятно быть первым, и на этой неделе их полно… от первого в мире жилого района на водородной основе в Нидерландах до первого в мире завода по производству 5-HMF в промышленных масштабах через новое Соглашение о совместных разработках AVA Biochem и Michelin Group.Times, они «меняются», и новости продолжают развиваться, когда разрабатывается самая большая система топливных элементов, которая когда-либо была установлена ​​на крупном судне, новое совместное предприятие с GF Biochemicals и расположенной в Омане Towell Engineering Group по производству левулиновой кислоты на биологической основе. кислоты, а также биорастворителей и биопластификаторов с использованием левулиновой кислоты; биоинженеры и экономисты работают вместе, чтобы определить, как древесина заменяет нефть в химической промышленности (как технологически, так и финансово).

Давайте погрузимся в 10 лучших инноваций недели, полных новинок.

Компания-первопроходец Greentech, компания AVA Biochem, объединяется с группой Michelin для разработки 5-HMF в промышленных масштабах

В Швейцарии компания AVA Biochem заключила соглашение о совместных разработках с группой Michelin для создания первого в мире завода по производству 5-HMF в промышленных масштабах и, в конечном итоге, для вывода на рынок новых продуктов на основе этого универсального химического вещества.

Компания Ava Biochem разработала, запатентовала и опробовала полностью водный процесс превращения промышленных сахаров в молекулу 5-HMF на 100% биологической основе.Этот платформенный химикат идеально подходит для замены химикатов из нефти в различных приложениях для массового потребителя благодаря своей универсальности, нетоксичности и возможности использования биологических источников. Применения включают биополимеры (например, пряжу, пленки, бутылки и другую упаковку), а также смолы и клеи, где 5-HMF заменяет высокотоксичный формальдегид.

«Мы гордимся тем, что работаем вместе с одним из самых инновационных игроков в своей отрасли. Сотрудничество с Michelin представляет собой прекрасную возможность для разработки экологически чистых промышленных продуктов.Это важный шаг вперед в стремлении AVA Biochem стать предпочтительным партнером и ключевым поставщиком экологически безопасных химических решений и всемирных лицензий для промышленных и потребительских товаров », — говорит Питер Ахерманн, председатель и соучредитель AVA Biochem.
Подробнее об истории здесь.

Первичное исследование присутствия гидроксиметилфурфурола (HMF) в ряде копченых продуктов

5-гидроксиметилфурфурол (HMF) вырабатывается в пищевых продуктах различными путями.Недавно исследования показали его потенциальные мутагенные и канцерогенные свойства. Определение HMF первоначально использовалось как индикатор степени термической обработки пищевых продуктов и их качества. Он был обнаружен в различных пищевых продуктах, таких как хлеб, сухие завтраки, фруктовые соки, молоко и мед. Помимо тепловых процессов, которые приводят к образованию HMF во время термической обработки, копчение пищевых продуктов также создает условия, которые приводят к образованию HMF.Это может происходить внутри пищевых продуктов из-за повышенных температур, связанных с горячим копчением, или из-за близости продуктов пиролиза древесной матрицы, используемой для копчения (холодное копчение). Это может привести к дальнейшему загрязнению продукта HMF сверх того, что связано с остальной частью процесса приготовления. До сих пор не проводилось исследований, изучающих связь между процедурой курения и загрязнением HMF копченой пищи. Это исследование является первичным, измеряя уровни HMF в трех категориях копченых пищевых продуктов, сыра, обработанного мяса и рыбы с помощью ВЭЖХ-УФ.Количество HMF, обнаруженное во всех трех категориях продуктов, подтверждает нашу гипотезу о том, что уровни HMF связаны как с внутренними путями во время обработки, так и с внешним загрязнением из используемой матрицы образования дыма (древесины). Результаты варьировались от 1 ppb (традиционный греческий копченый сыр мецовоне) до 4 ppm (готовая к употреблению скумбрия горячего копчения). Впоследствии для продуктов из копченого сыра была обнаружена корреляция между HMF и фенольными соединениями, образующимися в процессе копчения и идентифицированными с помощью SPME-GCMS.Было обнаружено, что образцы сыра, которые имели более высокие концентрации HMF, также имели более высокие концентрации сирингола и крезолов. Поэтому важно понимать влияние процедуры курения на образование HMF. Это поможет в разработке стратегий смягчения последствий для уменьшения образования HMF при сохранении вкуса копченых продуктов.

1. Введение

Копчение пищи — один из старейших методов консервирования и ароматизации пищевых продуктов [1].В настоящее время такая обработка используется для улучшения органолептических свойств некоторых продуктов питания за счет получения уникальных ароматов [2], возникающих из-за нанесенного дыма, обычно при сжигании древесины. Курение также может изменить цвет продуктов и способствовать обезвоживанию, которое влияет на текстуру и снижает рост бактерий. Продукты, которые обычно коптят, — это рыба и мясо, но эти методы также применяются к сырам и специям [3].

Горение древесины приводит к пиролизу / термическому разложению ее основных компонентов: целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина.В дыме древесины было обнаружено более 400 летучих соединений, причем фенолы в основном ответственны за дымный аромат [4]. Было обнаружено, что на процесс курения влияет ряд факторов. К ним относятся температура во время пиролиза, сорт древесины (твердая или мягкая древесина), часть древесины (сердцевина или заболонь), концентрация влаги в древесине и присутствие воздуха во время процесса [5]. Горячее копчение и холодное копчение — это естественные паровые методы, использующие дым, образующийся при горении в различных условиях.Температура для процессов горячего копчения обычно находится в диапазоне от 55 ° C до 80 ° C, а продолжительность короткая. Напротив, холодное копчение происходит в течение более длительных периодов времени и может длиться несколько дней при температуре от 15 ° C до 25 ° C [2, 4]. Тип полисахарида, присутствующего в древесине, приводит к образованию определенных продуктов разложения. Гемицеллюлоза составляет 20–35% от массы древесины и в основном содержит гексозы и пентозы, связанные β — (1,4) связями. Соединения, получаемые при пиролизе гемицеллюлозы, в основном представляют собой фураны и карбоновые кислоты, а также альдегиды, которые придают копченым продуктам характерный коричневый цвет.Целлюлоза представляет собой линейный полимер мономерных единиц глюкозы, соединенных связями β — (1,4), которые составляют примерно 40–50% древесины мягких и твердых пород. Пиролиз целлюлозы, в зависимости от температуры горения, может приводить к различным продуктам, таким как безводные сахара при более низких температурах и фураны, пираны и гликоальдегид при более высоких температурах [6]. Лигнин, сшитый полимер нескольких фенилпропаноидов, составляет 20-25% древесной матрицы и обеспечивает дым фенольными соединениями, в основном сиринголом (2,6-диметоксифенолом), эвгенолом (2-метокси-4- (проп-2- ен-1-ил) фенол), изоэвгенол (2-метокси-4- (проп-1-ен-1-илфенол), гваякол (2-метоксифенол), p -крезол (4-метилфенол) и фенол.Сообщается, что их можно использовать в качестве индикаторов температуры и продолжительности процесса копчения [7]. Фенолы и крезолы образуются в результате дальнейшего разложения гваяколов. Уровни сирингола выше при пиролизе древесины лиственных пород по сравнению с древесиной мягких пород, поскольку структура лигнина различается между двумя типами древесины, причем первый содержит больше сирингола [8].

Среди других компонентов в древесном дыме был обнаружен 5-гидроксиметилфурфурол (HMF) [9]. Существует два основных механизма образования HMF во время горения древесины: либо дегидратация гексоз в слабокислой среде, либо образующиеся в качестве промежуточного продукта в реакции Майяра [10].

Во время пиролиза целлюлоза сначала деполимеризуется с образованием нескольких безводных сахаров, в основном левоглюкозана. Различные уровни левоглюкозана возникают из-за разных источников горения. Впоследствии термическое разложение левоглюкозана приводит к разрыву 1,6-гликозидной связи и последующему образованию глюкопиранозы путем регидратации. Есть два пути производства HMF. Первый путь включает реакцию перегруппировки 1,6-ангидро- β -D-глюкопиранозы, а второй является результатом термического разложения левоглюкозана.Кроме того, дальнейшие реакции HMF приводят к образованию фурфурола и формальдегида дегидроксиметилированием фуранового кольца. Кроме того, согласно [11], фенол и бензол образуются в результате реакций перегруппировки HMF [12].

Другим основным путем образования HMF является реакция Майяра. Реакция Майяра играет важную роль во вкусе и внешнем виде продуктов и возникает во время приготовления. Реакция Майяра представляет собой сложную сеть неферментативных реакций с различными путями.Майяр начинается, когда аминогруппа аминокислоты или белка конденсируется с редуцирующим сахаром, что приводит к продуктам перегруппировки Амадори. На более поздней стадии происходит 1,2-енолизация, и HMF является промежуточным побочным продуктом в слабощелочных условиях [13]. Впоследствии HMF вступает в реакцию с азотсодержащими соединениями и полимеризуется, давая азотистые полимеры, известные как меланоидины, которые ответственны за коричневый цвет поверхности пищевых продуктов. Параметрами, в основном ответственными за количество и качество потемнения в результате реакции Майяра, являются источник сахара и аминогрупп, степень и тип термической обработки и pH [14].Карамелизация, контролируемый пиролиз сахаров, является еще одной неферментативной реакцией потемнения, которая происходит из-за термической обработки и также может приводить к образованию HMF [15].

HMF уже был идентифицирован и измерен во многих пищевых продуктах, таких как сухофрукты, хлеб, джемы, кофе, карамель, фруктовые соки, печенье, сухие завтраки, молоко и мед. Обнаружен ряд влияний на его формирование. Примеры: в печенье взаимосвязь между сахарами, в основном глюкозой, и концентрацией HMF является линейной.Было обнаружено, что для фруктовых соков кислотность во время гидролиза является важным фактором [16–21]. В меде измерение HMF является показателем качественного возраста и термической обработки, и существует строгий нормативный предел. Например, Постановление о меде (Шотландия) 2015 года устанавливает предел не более 40 мг / кг для всего меда, кроме пекарского меда, и не более 80 мг / кг для меда из тропических регионов. Кроме того, сообщалось, что HMF может образовываться, когда пчел кормят сахарозным сиропом с кислой ароматизирующей добавкой [22].

Определение уровней HMF в пищевых продуктах стало важным, поскольку HMF метаболизируется в организме человека в основном до 5-гидроксиметилфурфуроиновой кислоты (HMFA) [23] и до 5-сульфоксиметилфурфурола (SMF) [24, 25]. Серная группа SMF может быть легко удалена, что приводит к образованию сложного эфира с генотоксическим и мутагенным действием. Этот сложный эфир далее вступает в реакцию с ДНК, РНК и белками, что приводит к их повреждению. Работа была проведена с использованием экспериментов in vitro и in vivo на животных для определения степени канцерогенных свойств SMF [26–30].Крысы, получавшие мед с различными концентрациями HMF, показали неблагоприятные последствия для здоровья, поскольку концентрация HMF увеличивалась [31].

В этой статье было проведено первоначальное исследование присутствия HMF в копченых пищевых продуктах. Мы также сообщаем о нашей попытке связать масштабы и тип курения путем сравнения фенольных соединений, образующихся во время курения, с различными уровнями HMF.

2. Материалы и методы

2.1. Материалы

Образцы продуктов питания были приобретены у местных розничных торговцев в районе Данди.Муравьиная кислота была приобретена у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США), 5- (гидроксиметил) фурфурол (HMF) был у Fisher Scientific (98%, ACROS Organics ™, США), а набор для осветления Carrez был получен у Merck (Дармштадт, Германия).

2.2. Выборка

Для каждого из различных типов выборки использовалась соответствующая методика выборки. Для сыров кубик размером 8 см ³ был вырезан из основной части сыра и натерт на терке. Для обработанного мяса использовали ломтик размером порции (8 см × 8 см × 2 мм).Для рыбы мясо отделяли от кожи, и каждую обработку обрабатывали отдельно. Приблизительно 25 г каждого образца взвешивали на аналитических весах (Fisherbrand ™ Analytical Balances, Великобритания), лиофилизировали (сублимационная сушилка Edwards Micro Modulyo, США), измельчали ​​(WARING, коммерческий блендер, Абердин) и затем хранили при -20 ° C, пока не потребуется.

2.3. Анализ HMF

Для определения HMF использовался метод Fiore et al. [32] с некоторыми изменениями. Вкратце, 0,5 г измельченного образца помещали в центрифужную пробирку на 50 мл (Conical, Foam Rack, Sterile, Blue Cap, PP, Fisherbrand, США).Добавляли 9 мл сверхчистой воды (UPW) (с 0,1% муравьиной кислоты), затем 0,5 мл Carrez I (ферроцианид калия) и 0,5 мл Carrez II (ацетат цинка). Смесь гомогенизировали (IKA Dispersers T 18 digital ULTRA-TURRAX®, США) в течение 1 минуты, а затем центрифугировали в течение 10 минут при 4000 об / мин при 4 ° C (охлаждаемая настольная центрифуга Jouan CR3.12, США). Супернатант собирали в центрифужную пробирку на 50 мл. К осадку добавляли еще 5 мл UPW, раствор гомогенизировали и центрифугировали, как указано выше.Эту последнюю процедуру повторили еще раз после сбора супернатанта. Из объединенных слоев супернатанта 1 мл переносили в пробирку Эппендорфа (Fisherbrand, 1,5 мл) и центрифугировали в течение 10 минут при 14000 об / мин при 4 ° C (центрифуга Eppendorf 5417R, Канада). Супернатант собирали и пропускали через шприцевой фильтр Minisart 0,2 µ м (15 мм) во флаконы для ВЭЖХ (винт 10 мм, 2 мл, Phenomenex) и анализировали с помощью ВЭЖХ на оборудовании, состоящем из Thermo Scientific (Германия) Ultimate. 3000 Pump, диодно-матричный детектор Dionex DDA-100 и автосэмплер Dionex ASI-100 (Сан-Хосе, Калифорния).Подвижная фаза представляла собой метанол: UPW (90: 10) при скорости потока 0,8 мл / мин в изократических условиях. Используемая колонка представляла собой Synergy 4 мкм м Hydro-RP 80 A, 25 × 4,6 см (Phenomenex, США). Детектор с диодной матрицей был настроен на определение оптической плотности при 280 нм и 313 нм. Для расчета концентрации HMF была построена калибровочная кривая с диапазоном HMF от 20 до 1000 частей на миллиард (уравнение y = 0,0029 x и R ² = 0,9951).

2.4. Анализ летучих соединений

Для обнаружения летучих соединений использовался метод Гильена и Эррекальда [33] с модификациями. Вкратце, 2,00 г сухого образца помещали во флакон для SPME. Используемый прибор представлял собой QP2010 HS-SPME-GCMS, снабженный автосамплером AOC-5000 (Shimadzu, Tokyo, Japan). В качестве волокна для SPME использовали PDMS / DVB от Supelco (Великобритания) следующим образом: 10 минут инкубации при 60 ° C, затем 30 минут экстракции и 10 минут десорбции. А 30 м, 0.Внутренний диаметр 25 мм, 0,25 мкм толщина пленки м Капиллярная колонка Zebron ZB-воск (Phenomenex, США) использовалась с газом-носителем (He), установленным на общий поток 94 мл / мин и поток колонки 1,78 мл / мин. . Начальная температура термостата колонки составляла 40 ° C, повышаясь до 60 ° C при 4 ° C · мин ^-1 (выдержка 2 минуты), а затем до 190 ° C при 2 ° C · мин ^-1 и 230 ° C. при 5 ° C · мин ⁻¹ (выдержка 15 минут) для общего времени работы 97 минут. Температура впрыска составляла 250 ° C; режим закачки был без деления, время отбора пробы 1 минута.Температура источника ионов составляла 200 ° C, температура границы раздела 250 °, время отсечки растворителя 4,5 мин и диапазон масс 33–495. Наконец, напряжение ионизации составило 70 эВ. Аналиты были идентифицированы путем сравнения их масс-спектров с записанными в NIST 147.

2.5. Статистический анализ

Для статистического анализа использовался XLStat (версия 2014.5.03, Addinsoft, NY). Значительные различия между образцами с доверительным интервалом 95% были выполнены с использованием теста Тьюки, а для корреляции между концентрацией HMF и процентным содержанием летучих веществ использовался анализ главных компонентов (PCA).

3. Результаты и обсуждение

3.1. HMF

Анализ HMF с использованием ВЭЖХ с детектированием диодной матрицей при 280 нм и 313 нм был проведен на трех различных группах копченых продуктов (сыр, мясные полуфабрикаты и рыба). Были явные признаки присутствия HMF во всех трех категориях. Диапазон концентраций варьировался от 4 частей на миллиард (сыр мецовон) до 3000 частей на миллиард (скумбрия). Различный характер образцов (сыр, мясные и рыбные продукты) наряду с другими факторами, такими как тип копчения (горячее / холодное копчение) или использование конденсата дыма и тип горящей матрицы (древесина твердых, мягких пород и травы) считаются ответственными за различные уровни концентрации HMF, которые были идентифицированы.

3.1.1. Встречаемость HMF в сырных продуктах

На рисунке 1 представлены средние концентрации и стандартные отклонения HMF в образцах сыра. Образцы C1 и C2 имели самые высокие средние концентрации (657 частей на миллиард и 475 частей на миллиард соответственно), тогда как образец C3 имел самую низкую среднюю концентрацию 4 частей на миллиард. Для образцов C4, C5 и C6 средние концентрации варьировались от 48 до 88 частей на миллиард. С1, С2 и С3 (немецкие, голландские и греческие сыры соответственно) имели характерные коричневые корки, источник которых можно отнести к реакции Майяра или образованию альдегидов при термическом разложении [34].Интересно отметить, что образец C3 (мецовон, греч.) Имел самую низкую концентрацию HMF. Метсовоне — это традиционный копченый греческий сыр с защищенным обозначением происхождения (PDO). Его коптят холодным способом в течение 1-2 дней после созревания на естественном дыму от горящих трав, листьев и трав местности. Однако образцы C1 и C2 (немецкие и голландские сыры) копчены с использованием древесины в качестве горючего материала. Эти различия в дымообразующем материале могут быть причиной наблюдаемых концентраций HMF.Образец C4 (австрийский сыр) представлял собой плавленый сыр, полученный путем смешивания копченого чеддера и копченого масла, но конечный продукт не копченый; таким образом, этот другой процесс производства может быть причиной обнаруженного низкого уровня HMF. Наконец, образцы C5 и C6 представляют собой шотландские чеддеры одного и того же производителя (Оркнейские острова) однократного и тройного копчения, соответственно. Дым естественным образом образуется из древесины местных пород, в основном из твердых пород. Отсутствие коричневой корки может указывать на меньшее количество HMF по сравнению с образцами C1 и C2.Между двумя образцами (C5 и C6) тройной копченый (C6) имел немного более высокую концентрацию HMF, возможно, из-за дополнительного курения. Сложность анализа сырных продуктов может быть связана с трудностью, с которой столкнулись Моралес и Хименес-Перес [35] при анализе грудного молока, а именно сложностью соединений в термически обработанном молоке и тем фактом, что, как сообщалось, другие соединения совместно элюируются с HMF при хроматографическом анализе. Кроме того, тепловая обработка молока перед его превращением в сыр может повлиять на концентрацию HMF, как показано в работе Magarinos et al.[36].