Схема ванны da 963: 30W Ultrasonic Cleaner DA-963 / ультразвуковая ванночка

13.02.1978 alexxlab

Содержание

30W Ultrasonic Cleaner DA-963 / ультразвуковая ванночка

Здравствуйте! Выполняю обещание, данное менеджеру магазина EverBuying по написанию обзора данного товара, полученного бесплатно по программе EverBuying iTry.
Данная ультразвуковая (УЗ) ванночка это попытка номер 2 получить действительно УЗ ванну. Первый блин оказался комом (вот ссылка на обзор).
Однако эта попытка удалась, т.к. данная ванночка действительно ультразвуковая и она реально работает.

В достаточно объёмном обзоре фото снаружи и внутри корпуса устройства, а также видео процессов очистки с фотографиями до и после…

Начнём с теории

Что такое ультразвуковой очиститель?

Ультразвуковые очистители, иногда ошибочно называемые сверхзвуковыми очистителями, имеют рабочую частоту 20–40 кГц, и используются для очистки ювелирных украшений, линз и других оптических элементов, часов, стоматологических, хирургических и промышленных инструментов, а также регуляторов для дайвинга и промышленных запчастей. Ультразвуковой очиститель работает благодаря энергии, выделяющейся при схлопывании миллионов микроскопических кавитационных пузырьков вблизи загрязненной поверхности. При схлопывании кавитационных пузырьков образуется ударная волна, направленная на загрязненную поверхность.

Как работают ультразвуковые очистители?

Ультразвуковые очистители используются в тех случаях, когда микроскопические частицы загрязнения невозможно удалить другими способами. Помните, что ультразвуковые очистители используются не для очистки загрязненных предметов, а для удаления микроскопических частиц грязи, которые невозможно удалить иными способами. Сперва предмет следует очистить, и только после этого будет возможно применение ультразвукового очистителя.
К примеру, очистка ювелирных изделий ультразвуковым очистителем происходит благодаря образованию пустот, возникающих при формировании и последующем схлопывании микроскопических пузырьков с воздухом в очищающем растворе. Постоянно образующиеся и схлопывающиеся пузырьки служат чистящим средством, очищающим как открытые, так и труднодоступные места поверхности, покрытой чистящим раствором. С повышением частоты пузырьки воздуха образуются быстрее, из-за чего энергия, выделяемая при схлопывании пузырьков, снижается. Это образует идеальные условия для удаления небольших частиц загрязнения без повреждения самого объекта.

Пузырьки образуются ввиду распространения в жидкости ультразвуковых волн, имеющих высокую интенсивность и частоту. Очиститель ювелирных изделий состоит из небольшой емкости, в которую налит чистящий раствор, преобразователя электрической энергии в механическую, и ультразвукового генератора, излучающего сигнал высокой частоты.

Каковы преимущества ультразвуковых очистителей?
Ультразвуковая очистка имеет множество преимуществ, среди которых быстрота, стабильность и точность.

Быстрота обеспечивается за счет того, что при ультразвуковой очистке отсутствует необходимость разбирать изделия перед очисткой. Это особенно актуально для крупных ювелирных изделий. Благодаря тому, что изделия не требуется разбирать, очистка занимает значительно меньшее время, поскольку не требуется дополнительного труда, не говоря уже об экономии средств.

Точность – еще одно важное преимущество. Ультразвуковая очистка позволяет удалить загрязнение даже из небольших трещин и сколов. После подобной очистки украшения выглядят лучше, чем когда-либо, и, помимо самого украшения, также очищается оправа и составные части.
Заключительное преимущество – это стабильность. Ультразвуковые очистители обеспечивают превосходный уровень снятия загрязнения без сбоев. Они справляются с предметами разных форм и размеров.

Взято здесь: www.lightinthebox.com/ru/knowledge-base/c1165/a2652.html

Итак, как обычно фото посылки:Внутри этого конверта находилась коробка с обозреваемой УЗ ванночкой и симпатичная маечка/корсет, обзор которой уже был сдедан, вот ссылка. Фото коробки УЗ ванночки:Несложно заметить, что упаковочная коробка от этой ванночти практически не пострадала, чего не скажешь о майке/корсете (ссылка выше). Открываем:Ванночка в коробке фиксируется с помощью специальных пенопластовых вкладышей. В комплекте переходник под наши розетки и инструкция на английском и китайском языках:

увеличенные фрагменты англоязычной инструкции

Достаём ванночку из коробки:Размер устройства достаточно внушительный: 18х10х11 см. Ванночка и крышка сделана из нержавеющей стали, корпус устройства из блестящего пластика. Из органов управления присутствует одна кнопка включения/выключения и красный светодиод — индикатор работы. Переворачиваем:Днище корпуса крепится 4 винтами, к нему прикручены, а не приклеены 4 резиновые ножки.
Разбираем:Внутри находится основная плата, плата управления и пьезоизлучатель. Рассмотрим всё поотдельности:
Основная плата:Она содержит двухполупериодный выпрямитель без сглаживающих конденсаторов, ВЧ генераратор на 2 мощных транзисторах с обратной связью на ферритовом кольце, и ВЧ трансформатор питающий излучатель. Как видно из фото, плата ремонтная, видимо вышел из строя один из транзисторов, что привело к «испарению» печатных дорожек. Также необходимо заметить, что плата не отмыта от флюса, что тоже нехорошо.
Плата управления:Эта плата кроме кнопки и светодиода содержит параметрический таймер на RC-цепочке, а в качестве измерительного элемента микросхему CD4011 представляющую из себя 4 элемента 2И-НЕ. Замечу, что эта плата отмыта от флюса.
Пьезоизлучатель:Излучатель имеет 5 см в диаметре, приклеен эластичным клеем, напоминающим силикон.

Перейдём к испытаниям:

Тест №1 (вода и кольца с серьгами), фото подопытных образцов до мытья:Процесс мытья, прошу обратить внимание, что это не дым:

<div id="yandex_rtb_3" class="lazy lazy-hidden yandex-adaptive classYandexRTB"></div> <script type="text/javascript">if(rtbW>=960){var rtbBlockID="R-A-744089-3";} else{var rtbBlockID="R-A-744089-5";} window.yaContextCb.push(()=>{Ya.Context.AdvManager.render({renderTo:"yandex_rtb_3",blockId:rtbBlockID,pageNumber:3,onError:(data)=>{var g=document.createElement("ins");g.className="adsbygoogle";g.style.display="inline";if(rtbW>=960){g.style.width="580px";g.style.height="400px";g.setAttribute("data-ad-slot","9935184599");}else{g.style.width="300px";g.style.height="600px";g.setAttribute("data-ad-slot","9935184599");} g.setAttribute("data-ad-client","ca-pub-1812626643144578");g.setAttribute("data-alternate-ad-url",stroke2);document.getElementById("yandex_rtb_3").appendChild(g);(adsbygoogle=window.adsbygoogle||[]).push({});}})});window.addEventListener("load",()=>{var ins=document.getElementById("yandex_rtb_3");if(ins.clientHeight =="0"){ins.innerHTML=stroke3;}},true);</script>

Не пугайтесь, звук на самом деле не такой страшный, он напоминает треск, а не вот это «дринчание». В процессе мытья я для интереса попробовал капнуть средство для мытья посуды, но ничего не произошло 🙂
Фото колец после бани:Выводы: Кольца стали немного светлее, но главное исчезла грязь из мелких пазух, куда и щёткой-то не залезешь.

Тест №2 (спирт и печатная плата): Мыть будем плату зарядного устройства La Crosse RS-700, которое я недавно тут подробно обозревал (вот ссылка), а для мытья использовать изопропиловый спирт. Фото платы до мытья:Итак, всё готово к включению:Включаем:

Фото тех же участков платы после мытья:Вывод: Мыл всего 3 минуты и остатки флюса практически отмылись. Работает!!!

Следующую видеозапись постарался сделать с максимальным приближением, чтобы показать как всё это работает. Прошу обратить внимание на движение пузырьков:

Вот и конец данного обзора, резюмируя скажу, что я очень рад этой ванночке, она действительно работает! По цене в 22 доллара думаю нереально купить что-то подобное в обычных магазинах.

Спасибо за внимание, надеюсь обзор был интересен и будет полезен. Удачи!

Ультразвуковая ванна DADI 963 один режим работы 0.7L, 30W

Описание товара Ультразвуковая ванна DADI 963 один режим работы 0.7L, 30W

Маломощная портативная ультразвуковая ванна DADI 963 это провренное устройство для быстрой эффективной мойки сильно загрязненных предметов. В некоторых случаях применение традиционных химических и механических способов удаления загрязней приводит к неоправданно большим потерям времени и денежных средств.

Технические характеристики:

Напряжение питания: 220 Вольт;
Мощность генератора: 30W;
Частота генератора: 40 КГц;
Объем: 0,7 л;
Корпус: антистатический;
Материал бака: нержавеющая сталь;
Размер емкости: 165х85х45мм;
Общие габариты: 185х150х100 мм;
Вес: 0,6 кг.

Отличительные особенности

Особенности конструкции

Устройство оснащено микропроцессорным управлением. Орган управления состоит из одной кнопки : O/I (включение/выключение). Чтобы моющая жидкость не разбрызгивалась, в комплект поставки входит крышка. Под ней Вы обнаружите овальную емкость из нержавейки объемом 0,7л.

Какую жидкость можно использовать?

Самый простой вариант – залить обычную воду, а если хотите ускорить процесс очистки – добавьте моющее средство. Если Вы привыкли пользоваться специальной химией, можно заказать универсальный очиститель — изопропиловый спирт.

Как работает

Налейте воду (возможно с химическим средством) в емкость.
Поместите в бак загрязненный предмет и закройте крышку.
После включения в сеть 220В сетевого кабеля, УЗ ванночка находится в дежурном режиме.
Нажмите кнопку O/I, запуская ультразвуковой высокочастотный генератор. Процесс мойки начнется.
Контролируйте процесс очистки, периодически поднимая крышку.

Принцип работы

Применяемый способ очистки основан на преобразовании энергии генератора в высокочастотный сигнал, переходящий в физические колебания жидкой среды по всему объему мойки. Воздействие передается загрязненной поверхности очищаемого предмета. Этот процесс называется еще по-другому кавитация — процесс образования пузырьков: микровзрывы убирают частицы загрязнений.

Поскольку колебания передаются равномерно по всему объему, ультразвуковая ванна DADI 963 обладает важным свойством очищать загрязненные предметы со сложной формой, множеством отверстий и наличием труднодоступных мест.

В каких отраслях может применяется:

Первое и наверное главная причина покупки данного оборудования — это возможность быстрого удаления загрязнений: грязи, пыли, жира, твердых отложений от горюче-смазочных материалов.

Сервисные центры и мастерские по диагностике и ремонту электронной и бытовой техники применяют для удаления сложных загрязнений, накопившихся с годами с клеммников, разъемов, контактов, деталей мобильных гаджетов.
Радиолюбители для очистки печатной платы от загрязнений, в том числе от остатков флюса после пайки.
Золотые, серебряные украшения или монеты потеряли прежний блеск ? Хочется, чтобы брошь или цепочка сияли как новые ? Не только ювелиры, реставраторы или коллекционеры, а буквально каждый из Вас оценит «очистительную силу» современного оборудования.

Автомастерские, для очистки инжекторов, деталей карбюраторов с калиброванными миниатюрными отверстиями также будут качественно очищены.
В быту, при очиcтке очков, цепочек, компакт-дисков, расчесок, бритв, щеток, вставных зубов, чайных сервизов, и небольших бутылочек. Даже фрукты: вишня, виноград и клубника будут быстро не только вымыты посредством ультразвуковой обработки, но и к тому же простерилизованы в ванной.
Часовщики оценят возможность удалить загрязнения с мельчайших шестеренок механических часов.
Для точных оптических инструментов, особенно с высокой степенью увеличения, критически важно периодически убирать загрязнения с объективов микроскопов, телескопов, камер.

Сфера применения не ограничивается только удалением загрязнений:

для перемешивания разнородных жидкостей. Микровзрывы, формирующиеся посредством высокочастотных колебаний, размывают границы несовместимых сред.
для ускорение процессов растворения и перемешивания жидкостей.

По Вашему заказу, через корзину сайта или по телефону, ультразвуковая ванна DADI 963, будет доставлена по Киеву и Украине, купить можно в интернет магазине Electronoff, цена актуальная. При необходимости подберем замену от других брендов, с заданным функционалом, отвечающим постановке вашей задачи, выбрав из ассортимента, представленного у нас на сайте. На продукцию действует гарантия. Отправка почтовыми сервисами.

Самая дешёвая ультразвуковая ванна на AliExpress с местной доставкой

Ультразвуковые ванны для отмыва ювелирки, монет и печатных плат тут обозревались неоднократно. К сожалению, ни в одном из обзоров не упоминалась мелкая доработка, которая сильно улучшает устройство.

Героем обзора стала самая дешёвая ванна с доставкой с российского склада, какую только мог найти.

Про потребительские качества устройства мне сложно что-то добавить к предыдущим ораторам. Агрегат пластмассовый, поддона-сеточки в комплекте нет, герметка по периметру мало, сливать отработанный раствор сложно (если использовать растворители, подтёки будут портить пластик и подтачивать герметик), даже ножки резиновые не приклеены. Таймер — пятиминутный, чего, очевидно, мало.

Габариты — на фото продавца:

Товар был оплачен в ночь на понедельник, в среду утром курьер IML Express отзвонился и принёс его мне на работу.

К сожалению, производитель сэкономил на фильтре по питанию, отчего ванна зверски орёт на частоте 50 или 100 герц (в режимах полумоста и моста, соответственно). Записал короткое видео, в котором «для масштаба» сначала на фоне слышно негромко работающий телевизор:

Не перфоратор, конечно, но мозг выносит знатно.

Расковыриваем ванну и подпаиваем электролит 47мкФ 400 вольт к ногам штатного металлоплёночного конденсатора:

(заодно убеждаемся, что «сапожник без сапог» — плата отмыта, кхм, небезупречно).

Свинчиваем и снова включаем аппарат и наслаждаемся почти что тишиной:

После доработки мы, кажется, лишаемся «половинного» режима работы, но не жалко — проку с него нет. По ощущениям, излучатель с конденсатором работает гораздо мощнее — появляется стоячая волна и капли пытаются выскочить на стол.

Лучше всего УЗВ показывает себя с растворами спецсредств — для чистки ювелирки жены использовал «ТМ-Флай №2» в концентрации 4% — результат налицо. Закинул в ванну нож от триммера — за три минуты из него выбило всю грязь. После сушки и смазки триммер зашуршал как новенький.

По хорошему, надо было бы ещё вкрячить на плату какой-нибудь кулер для принудительного охлаждения и залить полкило сантехнического герметика внутрь между ванной и пластиковым корпусом, но это — в следующий раз.

Товар куплен за свои кровные:

Update: по просьбам трудящихся — тест с фольгой. Брал плотную толстую «для запекания», обработка 60 секунд. С конденсатором стало заметно мощнее, раньше за минуту появлялись только мелкие дырочки, различимые на свет, сейчас — сквозные дыры. Края тоже заметно подъело:

за последующие 4 минуты фольга «дезинтегрировалась»:

Ультразвуковая ванна(мойка) для инструментов, 2,5 л

Ультразвуковая мойка(ванна) модель UC-6300, 2,5 л.

Ультразвуковая чистка быстрее, более тщательна и безопасна чем любой другой метод очистки. Эти серии ультразвуковых ванн герметичны, безопасны и просты в обращении. Новая функция дегазации особенно полезно при пуске. Микропроцессорное управление термостата и цифровой дисплеей, позволяющим контролировать время цикла очистки и температуру

Встроенная функция нагрева до 65 градусов позволит осуществить тщательную и гигиеническую очистку. Безопасность нагрева обеспечивает качественный нагреватель, а предохранитель электрической цепи защитит ванну от возможных перегрузок. Длительный срок службы прибора также будет возможен благодаря охлаждающему вентилятору. Для удобства очистки ванночка оснащена съемной подставкой.

Характеристики:

Ванночка имеет цифровой светодиодный индикатором.

Встроенный таймер 1-8мин

Внутренняя емкость сделана из нержавеющей стали, ее объем составляет 2,5 л.

Габариты — 250х150х80.

Корпус выполнен из ударопрочного и водоотталкивающего пластика белого цвета.

Частота ультразвука составляет 40 кГц.

Мощность прибора — 70 Вт (1 усиленный преобразователь).

Необходимые требования к электропитанию: 220-240 В (50 Гц).

Размеры прибора — 294х209х167

В упакованном виде ванна имеет габариты — 340х250х235.

Ультразвуковая мойка (ванна) – это аппарат для предстерилизационной очистки медицинских инструментов и приборов. В стоматологии с ее помощью очищают от въевшихся загрязнений инструменты, эндофайлы, боры, протезы и т. д., в том числе и перед автоклавированием.

Преимущества ультразвуковых ванн.

Среди преимуществ этого типа оборудования выделим:

Непревзойденное очищение. В мойке даже труднодоступные места очищаются идеально, быстро и легко;
Эффективность. Ультразвук отлично устраняет загрязнения любого происхождения и сложности. Особенно по сравнению с ручной обработкой.
Бережное очищение. В результате обработки даже самая деликатная поверхность не повреждается, режущие части не затупляются, не оседают микроорганизмы, как, например, после использования щетки.
Экономный расход электроэнергии. При этом УЗ-мойки отличаются высокой производительностью.
Неизменные свойства дезраствора. Очищающая жидкость одинаково эффективна и активна на всех этапах дезинфекции. Поэтому не нужно использовать агрессивные средства.
Ультразвуковая очистка идеально подходит для металлических, пластмассовых, керамических, стеклянных и других хрупких предметов.

Рекомендации по выбору ультразвуковой мойки.

Мы рекомендуем учитывать несколько параметров, чтобы выбрать оптимальную модель ванны:

Габариты и объем. Определитесь с размером инструментов, которые вы будете обрабатывать в аппарате. Также учтите, что при одинаковом объеме ванны могут иметь разные габариты. Лучше брать модели большего объема – тогда вы одновременно сможете дезинфицировать большое количество инструментов, а ультразвуковая ванна при этом не перегрузится;
Мощность и рабочая частота аппарата. Чем выше эти параметры, тем лучше и быстрее мойка очищает;
Система подогрева. Есть модели с подогревом и без него. Лучше первый вариант – такие аппараты эффективнее;
Таймер и система контроля температуры. Есть модели с контролем и без него. Лучше первый вариант – тогда весь цикл обработки происходит автоматически, машина самостоятельно отключается, а вам не нужно следить за ее работой;
Материал. Выбирайте аппараты из нержавеющей стали или прочного пластика – оба варианта устойчивы к коррозии и повреждениям.

Теги: ультразвуковая мойка, ультразвуковая мойка алматы, ультразвуковая мойка купить, ультразвуковая мойка для маникюра, ультразвуковая мойка отзывы, ультразвуковая мойка деталей, ультразвуковая мойка для маникюра купить, ультразвуковая ванна, ультразвуковая ванна купить алматы, ультразвуковая ванна для очистки деталей, ультразвуковая ванна купить в казахстане, ультразвуковая ванна олх, ультразвуковая ванна лаунч, ультразвуковая ванна dadi da-963 30w, Ультразвуковая ванна ювелирная, уз мойка, ультразвуковая ванна купить, купить ультразвуковую ванну, купить ультразвуковую мойку, ультразвуковые ванны, ультразвуковая ванночка, уз ванна, ванна ультразвуковая, уз мойка купить, ультразвуковая мойка для маникюрных инструментов, узи мойка, ультразвукова ванна, ультразвуковые ванны купить, ультразвуковые мойки, ультразвуковая мойка для инструментов, купить уз мойку, ультразвуковая мойка для маникюрных инструментов купить, ультразвуковая ванночка купить, уз мойка для маникюрных инструментов, ультразвукова мойка, ультразвуковая ванна цена, уз мойки, уз мойка codyson 4830, ультразвуковая ванна для ювелирных изделий, ультразвуковая ванна для маникюрного инструмента, ультразвуковая ванна для инструментов, ультразвуковая камера, ультразвуковая мойка инструментов, ультразвуковая ванна для стоматологии, ультразвуковые ванны для стоматологии, ультразвуковая мойка для боров, ультразвуковая ванная

Челюсти дробилки, высокое качество и надежность из Китая

Челюсти дробилки, высокое качество и надежность из Китая | LEZO

КТО МЫ ЕСТЬ

Добро пожаловать в Хэнань LEZO

Henan LEZO Heavy Machinery Co., Ltd. — крупное акционерное общество, специализирующееся на производстве тяжелых Техника LEZO и гражданская техника; имеет шесть производственных баз площадью 240 000 м2, что составляет более 2000 существующих сотрудников и около 500 комплектов крупных и средних предприятий по обработке, клепке, сварке и монтажное оборудование.

Горячие продукты

Наши продукты хорошо продаются во всем мире и оснащены передовыми технологиями в области измельчения песка. шлифовальный порошок.

Ударная дробилка
Ударные дробилки также известны как ударные выключатели или ударные дробильные машины.
Конусная дробилка
Конусные дробилки также известны как конусные выключатели. Сила сжимания конусной дробилки не более 250 МПа.
Молотковая дробилка
Молотная дробилка состоит из корпуса корпуса, ротора, молотка, спина, вкладыши, сита и т. Д.
Роликовая дробилка
Валковая дробилка (роликовая дробилка) подходит для мелкого дробления материалов с размером подачи менее 110 мм, а заканчивая размером 3-30 мм.
Гусеничный тип мобильной челюсти дробилка
Гусеничный тип мобильной дробилки или дробильный завод мобильной связи гусеничного типа, сделанные нашей компанией, сочетают в себе преимущества как мобильной дробильной станции, так и дробилки челюсти.
Колесо мобильная челюсть дробилка
Колесо мобильная челюсти Crusher также известна как мобильная челюсть дробления или съемная мобильная дробилка челюсти.

Горячие Решения

Мы предлагаем качественные и эффективные решения для наших клиентов по всему миру.

Камень дробления производственной линии
Каменное дробильное растение также называемое рок-дробильным заводом или завод каменной дробилки, относится к выделенному устройству, используемому для строительного производства песка и камня.
Линия производства песка Ceramsite
Линия производства песка Ceramsite (или легкая развернутая производственная линия совокупности глины, легкий совокупный завод, производственная линия для производства песка Ceramsite, Ceramsite Production Production Production Production Production Production Production Ceramsite) принадлежит к строительному материалу.
Бразилия 500TPH дробления производственной линии
Линия дробления Бразилии в основном состоит из мобильной дробилки челюсти, одноцилиндровой конусной дробилки и двух композитных дробилок. Мобильная дробилка челюсти используется для одноразового дробления. Одноцилиндровая конусная дробилка используется для вторичного дробления. Составная дробилка используется в течение трех раз дробления.
Золотая линия рудника в Южной Африке
Процесс разделения флотации использовался для выбора золотой руды, а производственная линия объединялась с фактическим производством, что преодолевает много недостатков исходного процесса производства золота и проведенного технической трансформацией процессов.

вход кальция опосредован GLR3.3, рецептором глутамата Arabidopsis с широким профилем агонистов | Физиология растений

Аннотация

Аминокислоты глутамат (Glu) и глицин (Gly) вызывают большое, быстрое повышение концентрации Ca ²⁺ в цитозоле и сопутствующее повышение мембранного потенциала (деполяризации) у растений. Возможность того, что растительные гомологи нейрональных ионотропных глутаматных рецепторов опосредуют эти нейроноподобные ионные ответы, была проверена на проростках Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ) с использованием комбинации измерений Ca ²⁺, электрофизиологии и обратной генетики.Деполяризация мембраны, запускаемая Glu, была значительно снижена или полностью заблокирована в некоторых условиях мутациями в GLR3.3 , одном из 20 генов GLR Arabidopsis. Те же мутации полностью блокировали связанный с этим рост цитозольного Ca ²⁺. Эти результаты генетически демонстрируют участие рецептора глутамата в быстрых ионных ответах на аминокислоту. Независимый от GLR3.3 компонент деполяризации требовал концентрации Glu выше 25 μ m, не проявлял десенсибилизации и сильно подавлялся увеличением внеклеточного pH.Предполагается, что это результат симпорта H ⁺ -аминокислота. Шесть аминокислот, обычно присутствующих в почвах (Glu, Gly, аланин, серин, аспарагин и цистеин), а также трипептид глутатион ( γ -глутамил-цистеинил-Gly) оказались сильными агонистами GLR3.3- опосредованные ответы. Все другие аминокислоты вызывали небольшую деполяризацию, аналогичную предполагаемому симпортерному компоненту, не относящемуся к GLR, и в большинстве случаев вызывали незначительное повышение Ca ²⁺ или вообще не вызывали его. Из этих результатов можно сделать вывод, что восприятие шести аминокислот в ризосфере и, возможно, внеклеточных пептидов связано с передачей сигналов Ca ²⁺ через GLR-зависимый механизм, гомологичный фундаментальному компоненту передачи сигналов нейронов.

Кратковременное повышение цитозольной концентрации Ca ²⁺ — это ранний этап процесса, с помощью которого многие стимулы преобразуются в физиологический ответ или реакцию развития. У растений такие раздражители включают свет, гормоны, температуру, микробы и прикосновение (Sanders et al., 2002; Hetherington and Brownlee, 2004; Hepler, 2005). Переходные процессы кальция могут быть результатом притока Ca ²⁺ через плазматическую мембрану и / или высвобождения Ca ²⁺ в цитоплазму из внутренних хранилищ.Недавно было показано, что канал TPC1 Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ) проводит Ca ²⁺ из вакуоли в цитоплазму (Peiter et al., 2005). Однако на молекулярном уровне почти ничего не известно о проникновении Ca ²⁺ через плазматическую мембрану, что является фундаментальной проблемой физиологии растительных клеток. Управляемые циклическими нуклеотидами каналы являются кандидатами на роль каналов притока Ca ²⁺ на плазматическую мембрану (Véry and Sentenac, 2002; White et al., 2002; Lemtiri-Chlieh and Berkowitz, 2004), но на сегодняшний день мало доказательств. роль для них в генерации цитозольного сигнала Ca ²⁺.Рецепторы глутамата также являются кандидатами на путь притока (Lacombe et al., 2001; Véry and Sentenac, 2002; White et al., 2002). Геном Arabidopsis содержит семейство из 20 генов GLR , гомологичных ионотропным (ионопроводящим) глутаматным рецепторам, которые опосредуют синаптическую передачу и генерируют сигналы Ca ²⁺ в центральной нервной системе млекопитающих (Chiu et al., 1999; Lacombe et al., 2001; Давенпорт, 2002). В синапсах Glu, высвобождаемый пресинаптической клеткой, открывает каналы рецептора глутамата в постсинаптической клетке, вызывая приток Ca ²⁺, K ⁺ и Na ⁺ (Dingledine et al., 1999; Мэдден, 2002). Результирующая деполяризация мембраны распространяет импульс, и повышение Ca ²⁺ влияет на многие постсинаптические процессы, включая синаптическое кондиционирование, которое лежит в основе обучения (Ghosh and Greenberg, 1995).

У Arabidopsis, Glu и Gly вызывают очень большие и быстрые изменения цитозольного Ca ²⁺ (Dennison and Spalding, 2000; Dubos et al., 2003; Meyerhoff et al., 2005). Повышение Ca ²⁺, вызванное Glu, сопровождается значительной временной деполяризацией мембраны, которая, по крайней мере частично, обусловлена притоком Ca ²⁺ через плазматическую мембрану (Dennison and Spalding, 2000; Meyerhoff et al., 2005). Исследование patch-clip пришло к выводу, что Glu активирует неспецифические катионные каналы в клетках корня, которые могут быть проводимостью, ответственной за эти ионные ответы (Demidchik et al., 2004). Избыточная экспрессия GLR3.2 привела к ухудшению здоровья растений, которое улучшалось обработкой Ca ²⁺, и к гиперчувствительности к K ⁺ и Na ⁺ (Kim et al., 2001). Было показано, что Glu деполяризует мембрану, деполимеризует кортикальные микротрубочки и замедляет рост корней в течение нескольких минут (Sivaguru et al., 2003). Все эти наблюдения согласуются с действием ионотропных рецепторов глутамата на плазматическую мембрану растений. Однако нет более прямых доказательств, чем эффекты ингибиторов iGluR животных, связывающие гены Arabidopsis GLR с транспортом Ca ²⁺ или какой-либо электрофизиологической реакцией (Dennison and Spalding, 2000; Dubos et al., 2003; Meyerhoff et al. ., 2005). Необходим генетический тест связи между генами GLR и ионными ответами, которые быстро следуют за обработкой аминокислотами.

Когда Этертон и его коллеги впервые описали деполяризации в ответ на аминокислоты в растениях, результаты были интерпретированы с точки зрения переносчиков нескольких аминокислот и последующей активной экструзии протонов (Etherton and Rubinstein, 1978; Kinraide and Etherton, 1980; Kinraide and Этертон, 1982). На сегодняшний день нет генетических или молекулярных данных, препятствующих такой интерпретации ионных реакций на аминокислоты. Возможно, что рецепторы глутамата растений развили другую физиологическую функцию и что они не образуют управляемых лигандами ионных каналов, подобных их нейрональным аналогам.В самом деле, аминокислотная последовательность в предсказанной области поры GLR растений значительно отличается от таковой ионотропных глутаматных рецепторов животных, что может свидетельствовать об очень другой или даже нулевой функции транспорта ионов (Davenport, 2002). Если, с другой стороны, можно было бы показать, что ген GLR отвечает за компонент ионных ответов на Glu у растений, будет продемонстрировано, что фундаментальный аспект нейрональной передачи сигналов действует в сложной, многоклеточной, но аневральный организм.Любая связь между геном GLR растения и переходным процессом Ca ²⁺, запускаемым Glu, добавила бы столь необходимую молекулярную информацию к теме того, как сигналы Ca ²⁺ генерируются в растениях. Настоящее исследование рассматривает функцию растительных молекул GLR с помощью комбинации обратных генетических и клеточных физиологических методов.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Десенсибилизация ионных ответов на Glu

Десенсибилизация является важным способом регуляции лиганд-управляемых каналов, которые участвуют в передаче сигналов Ca ²⁺ в синапсах центральной нервной системы (Jones and Westbrook, 1996).Glu-индуцированная деполяризация мембран в клетках мезофилла листа проявляет десенсибилизацию (Meyerhoff et al., 2005), что согласуется с возможностью того, что лиганд-зависимые каналы ответственны за электрические эффекты аминокислот. Если электрические ответы на Glu и цитозольный рост Ca ²⁺, запускаемый Glu, являются проявлениями одного и того же механизма (например, активация лиганд-управляемых каналов), то оба должны демонстрировать десенсибилизацию. Это было исследовано на проростках Arabidopsis с помощью экспериментов с использованием проростков, экспрессирующих экворин, для измерения изменений Ca ²⁺ и внутриклеточных микроэлектродов для измерения мембранного потенциала.Рисунок 1A

Рисунок 1.

Десенсибилизация ионных ответов на Glu. A, Циклы нанесение Glu-вымывание, обозначенные чередующейся черной и белой полосой, показывают, что большая быстрая деполяризация мембраны наблюдается только в ответ на первое воздействие Glu (1000 мкм мкм, черный). Первоначальный ответ не зависел от pH, но меньшие последующие ответы на Glu были сильно подавлены повышением pH с 5,7 до 7,7. Обе кривые представляют собой средние значения четырех независимых экспериментов с SEM, показанных в произвольно выбранных временных точках.В. Предварительная обработка проростков дикого типа, экспрессирующих экворин, указанной концентрацией Glu вызвала снижение ответа на последующее нанесение 1000 мкл мкл Glu через 3 часа. Показанные кривые — это средние значения по крайней мере трех испытаний. Врезка: график ответа Ca ²⁺ в зависимости от предварительной обработки Glu, полученный путем интегрирования каждого из испытаний и последующего усреднения интегралов. Точки данных представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка. Десенсибилизация отклика Ca ²⁺ произошла в диапазоне концентраций Glu, который, как ожидается, будут испытывать корни в почве.

Рисунок 1.

показывает, что Glu запускает большую, быструю, временную деполяризацию мембраны в клетках верхушки корня Arabidopsis, аналогично предыдущим сообщениям (Dennison and Spalding, 2000; Sivaguru et al., 2003). После переключения проточного раствора для ванны на среду, не содержащую клей, мембранный потенциал вернулся к своему первоначальному значению. Второе нанесение Glu привело к меньшей деполяризации; большая начальная компонента была десенсибилизирована. Вторая деполяризация была многократно обратимой, т.е.е. это не уменьшило чувствительность. Когда эксперимент проводился при внешнем pH 7,7, начальная деполяризация была аналогична отклику, полученному при pH 5,7. Однако при более высоком pH реакция на последующее нанесение Glu значительно подавлялась. Влияние pH на недесенсибилизированный компонент может быть объяснено ниже.

Повышение Ca ²⁺ также показало десенсибилизацию. На рисунке 1В показано, что предварительная обработка 10 мкл мкл Glu вызвала 25% снижение реакции Ca ²⁺ на последующее нанесение 1000 мкл мкл Glu, в то время как 100 мкл мкл Glu снизила чувствительность на 56%.Снижение реактивности не было связано с уменьшением способности экорина сообщать о Ca ²⁺, потому что даже 2-часовая предварительная обработка 1000 μ m Glu не влияла на реакцию Ca ²⁺ на холодовой шок ( данные не показаны). Приведенные выше данные показывают, что как повышение Ca ²⁺, так и деполяризация мембраны демонстрируют явление десенсибилизации, как можно было бы ожидать, если бы оба они были результатом активации Glu ионных каналов GLR.

Генетическая связь между ионными ответами на аминокислоты и GLR3.3

Повышение уровня Glu-gated Ca ²⁺, включающее приток через плазматическую мембрану и десенсибилизацию, является лишь косвенным свидетельством GLR-опосредованного механизма притока Ca ²⁺, действующего в растениях. Более формальная связь между ионным феноменом и семейством генов GLR будет установлена, если мутация в одном или нескольких членах семейства повлияет на ионный ответ на Glu. Мутанты по инсерции (нокауту) Т-ДНК для 18 членов семейства были получены из коллекции Солка (http: // signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress) и glr гомозигот были проверены на аберрантные электрофизиологические ответы на Glu. Один из нокаутов, glr3.3 , реагировал на применение определенных аминокислот совершенно иначе, чем у дикого типа. В то время как 10 μ m Glu вызывал деполяризацию мембраны 34 ± 4 мВ ( n = 3) в корнях дикого типа (Рис. 2A

Рис. 2.

Сравнение ионных ответов, индуцированных Glu в корнях дикого типа. и мутантов glr .A, Деполяризации увеличивались по величине и изменяли форму, когда концентрация Glu увеличивалась с 10 до 1000 мк м у дикого типа. Внешняя среда имела pH 5,7. B: Ответы glr3.3-1 на 10 μ m Glu не были обнаружены. Устойчивая деполяризация индуцировалась у мутанта за счет концентраций Glu, равных или превышающих 100 μ m. C. Зависимость деполяризации от GLR3.3 подтверждается независимым аллелем glr3.3-2 .D, При pH 7,7 ответ дикого типа на 1000 мкл м Glu (черный) был большим, а мутантный ответ почти отсутствовал (красный). Все показанные кривые мембранного потенциала представляют от трех до девяти независимых испытаний. В тексте указаны средние пиковые отклики. E: изменение цитоплазматического Ca ²⁺, индуцированное 1000 μ m Glu у дикого типа ( n = 12), было отменено в двух независимых мутантных аллелях glr3.3 ( n = 6, 7 ).F, изменение цитоплазматического Ca ²⁺, индуцированное 1000 μ m Gly у дикого типа ( n = 12), отсутствовало в двух независимых мутантных аллелях glr3.3 ( n = 7, 8). ).

Рисунок 2.

Сравнение ионных ответов, индуцированных Glu в корнях дикого типа и мутантах glr . A, Деполяризации увеличивались по величине и изменяли форму, когда концентрация Glu увеличивалась с 10 до 1000 мк м у дикого типа.Внешняя среда имела pH 5,7. B: Ответы glr3.3-1 на 10 μ m Glu не были обнаружены. Устойчивая деполяризация индуцировалась у мутанта за счет концентраций Glu, равных или превышающих 100 μ m. C. Зависимость деполяризации от GLR3.3 подтверждается независимым аллелем glr3.3-2 . D, При pH 7,7 ответ дикого типа на 1000 мкл м Glu (черный) был большим, а мутантный ответ почти отсутствовал (красный). Все показанные кривые мембранного потенциала представляют от трех до девяти независимых испытаний.В тексте указаны средние пиковые отклики. E: изменение цитоплазматического Ca ²⁺, индуцированное 1000 μ m Glu у дикого типа ( n = 12), было отменено в двух независимых мутантных аллелях glr3.3 ( n = 6, 7 ). F, изменение цитоплазматического Ca ²⁺, индуцированное 1000 μ m Gly у дикого типа ( n = 12), отсутствовало в двух независимых мутантных аллелях glr3.3 ( n = 7, 8). ).

) ответ полностью отсутствовал у двух независимых glr3.3 нокаутных растений (рис. 2, Б и В). Увеличение Glu до 100 мкм м увеличивало пиковую величину изменения напряжения дикого типа до 65 ± 4 мВ ( n = 9), но средние ответы glr3.3-1 и glr3.3- 2 корня составляли всего 20 ± 4 мВ и 22 ± 5 мВ соответственно ( n = 9 для каждого). Остаточная деполяризация у мутантов glr3.3 существенно увеличилась, когда обработка Glu была увеличена до 1000 μ m (рис.2, Б и В). GLR3.3-независимый компонент деполяризации может быть результатом симпорта H ⁺-связанных аминокислот (Fischer et al., 1998), потому что изменение внешнего pH с 5,7 до 7,7 почти полностью устраняет его (рис. 2D), как наблюдалось для недесенсибилизирующего компонента ответа дикого типа (фиг. 1A). Начало предполагаемой активности симпорта аминокислот при концентрации Glu от 10 до 100 мкМ мкм хорошо согласуется с предыдущими исследованиями электрогенного поглощения Glu переносчиком аминокислот Arabidopsis (Boorer et al., 1996).

Чтобы определить, зависело ли повышение Ca ²⁺ также от рецептора глутамата GLR3.3, флуоресцентный репортер Ca ²⁺ (желтый камелеон YC2.1; (Allen et al., 1999) был введен в два glr3.3 путем скрещивания.Фиг. 2E показывает, что даже высокая концентрация 1000 μ m Glu не вызывала повышения Ca ²⁺ ни в одной из мутантных линий, в то время как ответ дикого типа был устойчивым. коагонист некоторых рецепторов глутамата животных, как было показано, вызывает Glu-подобный ответ Ca ²⁺ у Arabidopsis (Dubos et al., 2003; Meyerhoff et al., 2005). Мутации glr3.3 также блокировали ответ Ca ²⁺ на Gly (рис. 2F). Репортер YC2.1 был функциональным в линиях glr3.3 , поскольку холодовой шок вызывал повышение Ca ²⁺ у мутанта, аналогичное дикому типу (данные не показаны). Фотообесцвечивание акцептора желтого флуоресцентного белка (YFP) уменьшало соотношение FRET и почти полностью подавляло ответ на Gly (данные не показаны), указывая на то, что зарегистрированный сигнал был достоверной мерой цитозольной концентрации Ca ²⁺.Эти результаты недвусмысленно демонстрируют, что повышение концентрации Ca ²⁺ в цитоплазме и сопутствующая деполяризация мембраны, запускаемая Glu или Gly, зависят от GLR3.3. Эти результаты представляют собой формальную генетическую связь между семейством генов GLR и быстрыми ионными ответами, запускаемыми аминокислотами.

Регулирование притока Ca

²⁺ микромолярным глюком Приведенные выше результаты согласуются с тем, что GLR3.3 опосредует внутренний поток Ca ²⁺ через плазматическую мембрану.Если это так, то величина деполяризации и цитозольных ответов Ca ²⁺ на Glu должна зависеть от внеклеточной концентрации Ca ²⁺. Рисунок 3A

Рисунок 3.

Влияние увеличения внеклеточного Ca ²⁺ на GLR3.3-опосредованные ответы на микромолярный Glu. A. Увеличение внешнего Ca ²⁺ с 1 мм до 10 мм увеличивало величину деполяризации мембраны, вызванной 25 μ m Glu. Даже при более высокой концентрации Ca ²⁺ glr3.3-1 клетки корня не деполяризовались в ответ на такой низкий уровень Glu. Аллель glr3.3-2 также не ответил (данные не показаны). См. Текст для средних пиковых значений. B, Повышение цитозольного Ca ²⁺ в ответ на 25 μ m Glu было обнаружено в клетках корня дикого типа, погруженных в 10 мм Ca ²⁺ ( n = 7), но не при внешнем Ca ²⁺ составлял 1 мм ( n = 4). Даже при наличии 10 мм внешнего Ca ²⁺, glr3.3-1 мутанты не показали поддающегося обнаружению ответа на 25 μ m Glu ( n = 6). C. Повышение цитозольного Ca ²⁺ (оцениваемое по люминесценции экворина) в ответ на сдвиги внешнего Ca ²⁺ с 1 мм до 10 мм было значительно усилено предварительной обработкой 10 μ m Glu. n = 8 для испытаний 0 Glu и n = 13 для 10 испытаний μ m Glu.

Рисунок 3.

Влияние увеличения внеклеточного Ca ²⁺ на GLR3.3-опосредованные ответы на микромолярный Glu. A. Увеличение внешнего Ca ²⁺ с 1 мм до 10 мм увеличивало величину деполяризации мембраны, вызванной 25 μ m Glu. Даже при более высокой концентрации Ca ²⁺ клетки корня glr3.3-1 не деполяризовались в ответ на этот низкий уровень Glu. Аллель glr3.3-2 также не ответил (данные не показаны). См. Текст для средних пиковых значений. B, Повышение цитозольного Ca ²⁺ в ответ на 25 μ m Glu было обнаружено в клетках корня дикого типа, погруженных в 10 мм Ca ²⁺ ( n = 7), но не при внешнем Ca ²⁺ составлял 1 мм ( n = 4).Даже в присутствии 10 мМ внешнего Ca ²⁺, glr3.3-1 мутантов не проявляли детектируемого ответа на 25 μ m Glu ( n = 6). C. Повышение цитозольного Ca ²⁺ (оцениваемое по люминесценции экворина) в ответ на сдвиги внешнего Ca ²⁺ с 1 мм до 10 мм было значительно усилено предварительной обработкой 10 μ m Glu. n = 8 для испытаний 0 Glu и n = 13 для 10 испытаний μ m Glu.

показывает, что увеличение внешнего Ca ²⁺ от 1 до 10 мм увеличивало пиковую деполяризацию мембраны, вызванную 25 μ m Glu (с 41 ± 6 мВ; n = 4 до 86 ± 6 мВ; n = 5). Повышение Ca ²⁺, вызванное 25 μ m Glu, также усиливалось увеличением внешней концентрации Ca ²⁺ (рис. 3B). Оба Ca ²⁺-зависимых ответа были отменены мутацией glr3.3-1 (рис. 3, A и B). Эти результаты показывают, что GLR3.3 требуется для транспорта Ca ²⁺ через плазматическую мембрану из апопласта в ответ на Glu.

Стимулируя активность GLR, не вызывая значительной десенсибилизации, низкие концентрации Glu в ризосфере могут регулировать проницаемость для Ca ²⁺ плазматической мембраны корня. Это было проверено путем определения влияния изменений внеклеточного Ca ²⁺ на цитозольный Ca ²⁺ в постоянном присутствии или отсутствии 10 мкМ м Glu. Проростки, экспрессирующие экворин, использовали для этого анализа влияния Glu на поступление Ca ²⁺, вызванное изменением градиента электрохимического потенциала Ca ²⁺.В отсутствие экзогенного Glu 10-кратное увеличение внеклеточной концентрации Ca ²⁺ (с 1–10 мм) мало влияло на цитоплазматическую концентрацию Ca ²⁺ (рис. 3C). Либо мембрана не была очень проницаема для Ca ²⁺, либо приток, возникающий в результате этого изменения, эффективно управлялся с помощью механизма гомеостатического оттока, либо и то, и другое. Однако в постоянном присутствии 10 μ m Glu такой же сдвиг внеклеточного Ca ²⁺ вызвал существенное повышение цитоплазматического Ca ²⁺ (рис.3С). Таким образом, хроническое воздействие 10 μ m Glu увеличивало легкость проникновения Ca ²⁺ в цитоплазму.

Профиль широкого агониста GLR3.3

Хотя Glu часто является самой распространенной аминокислотой, обнаруживаемой в почвах, некоторые другие часто присутствуют в заметных количествах (Abuarghub, Read, 1988; Kielland, 1994; Jones et al., 2005). Чтобы определить, могут ли другие вызвать GLR3.3-зависимую активность в корнях, необходимо оценить эффективность всех 20 l-аминокислот, а также d-Glu, d-Ser, d-Ala, NMDA и γ -аминомасляной кислоты (ГАМК). ) был определен.Из тестируемых соединений Ala, Asn, Cys и Ser запускали большие временные деполяризации мембран, которые были зависимы от GLR3.3 и во всех отношениях сходны с ответами Glu или Gly (Таблица I

Таблица I.

Пиковое изменение мембранного потенциала, индуцированное на 1000 мкМ шести эффективных аминокислот или глутатиона в мутантах дикого типа и glr3.3

Показанные значения представляют собой среднее изменение пика в мВ ± SEM.

= 6)

Генотип .	Аминокислоты .						.	.	.
Генотип .	.	Ала .	Асн .	Cys .	клей .	Гли .	Ser .	GSH .	GSSG .
Дикий тип	117 ± 11	87 ± 7	91 ± 1	83 ± 5	98 ± 8	90 ± 12	104 ± 15	43 ± 3
	( n = 3)	( n = 3)	( n = 4)	( n = 8)	( n = 7)	n = 3)	( n = 7)	( n = 10)
glr3.3-1	46 ± 13	41 ± 3	45 ± 3	38 ± 2	47 ± 4	47 ± 4	19 ± 6	22 ± 3
	( n = 4)	( n = 5)	( n = 3)	( n = 7)	( n = 6)	( n = 3)	( n = 4)	( n = 5)
glr3.3-2	41 ± 3	50 ± 4	40 ± 2	44 ± 6	38 ± 5	43 ± 6	31 ± 4	18 ± 4
	( n = 3)	( n = 3)	( n = 3)	( n = 7)	( n	( n = 3)	( n = 4)	( n = 4)

= 6)

Генотип .	Аминокислоты .						.	.	.
Генотип .	.	Ала .	Асн .	Cys .	клей .	Гли .	Ser .	GSH .	GSSG .
Дикий тип	117 ± 11	87 ± 7	91 ± 1	83 ± 5	98 ± 8	90 ± 12	104 ± 15	43 ± 3
	( n = 3)	( n = 3)	( n = 4)	( n = 8)	( n = 7)	n = 3)	( n = 7)	( n = 10)
glr3.3-1	46 ± 13	41 ± 3	45 ± 3	38 ± 2	47 ± 4	47 ± 4	19 ± 6	22 ± 3
	( n = 4)	( n = 5)	( n = 3)	( n = 7)	( n = 6)	( n = 3)	( n = 4)	( n = 5)
glr3.3-2	41 ± 3	50 ± 4	40 ± 2	44 ± 6	38 ± 5	43 ± 6	31 ± 4	18 ± 4
	( n = 3)	( n = 3)	( n = 3)	( n = 7)	( n	( n = 3)	( n = 4)	( n = 4)

Таблица I.

Пиковое изменение мембранного потенциала, индуцированное 1000 мкМ шести активных аминокислот или глутатиона у мутантов дикого типа и glr3.3

Показанные значения представляют собой среднее изменение пика в мВ ± SEM.

= 6)

Генотип .	Аминокислоты .						.	.	.
Генотип .	.	Ала .	Асн .	Cys .	клей .	Гли .	Ser .	GSH .	GSSG .
Дикий тип	117 ± 11	87 ± 7	91 ± 1	83 ± 5	98 ± 8	90 ± 12	104 ± 15	43 ± 3
	( n = 3)	( n = 3)	( n = 4)	( n = 8)	( n = 7)	n = 3)	( n = 7)	( n = 10)
glr3.3-1	46 ± 13	41 ± 3	45 ± 3	38 ± 2	47 ± 4	47 ± 4	19 ± 6	22 ± 3
	( n = 4)	( n = 5)	( n = 3)	( n = 7)	( n = 6)	( n = 3)	( n = 4)	( n = 5)
glr3.3-2	41 ± 3	50 ± 4	40 ± 2	44 ± 6	38 ± 5	43 ± 6	31 ± 4	18 ± 4
	( n = 3)	( n = 3)	( n = 3)	( n = 7)	( n	( n = 3)	( n = 4)	( n = 4)

= 6)

Генотип .	Аминокислоты .						.	.	.
Генотип .	.	Ала .	Асн .	Cys .	клей .	Гли .	Ser .	GSH .	GSSG .
Дикий тип	117 ± 11	87 ± 7	91 ± 1	83 ± 5	98 ± 8	90 ± 12	104 ± 15	43 ± 3
	( n = 3)	( n = 3)	( n = 4)	( n = 8)	( n = 7)	n = 3)	( n = 7)	( n = 10)
glr3.3-1	46 ± 13	41 ± 3	45 ± 3	38 ± 2	47 ± 4	47 ± 4	19 ± 6	22 ± 3
	( n = 4)	( n = 5)	( n = 3)	( n = 7)	( n = 6)	( n = 3)	( n = 4)	( n = 5)
glr3.3-2	41 ± 3	50 ± 4	40 ± 2	44 ± 6	38 ± 5	43 ± 6	31 ± 4	18 ± 4
	( n = 3)	( n = 3)	( n = 3)	( n = 7)	( n	( n = 3)	( n = 4)	( n = 4)

; Дополнительный рис.S1A). Каждая из этих эффективных аминокислот также вызвала повышение уровня Ca ²⁺, как было определено с помощью люминесценции экворина (дополнительный рисунок S1A; дополнительная таблица S1). Этот результат является неожиданным, поскольку известно, что Ala, Asn и Cys не являются агонистами рецепторов глутамата животных и отличаются по структуре. Из них Cys был выбран для дальнейшего изучения. Большое повышение цитозольного Ca ²⁺, вызванное 1000 μ m Cys у дикого типа, полностью отсутствовало в экспрессирующем камелеон glr3.3 мутанта , но нормальные в линии, гетерозиготной по мутации glr3.3 (данные не показаны). Таким образом, шесть аминокислот (Glu, Gly, Ser, Ala, Asn и Cys) можно рассматривать как агонисты GLR3.3-зависимого механизма притока Ca ²⁺. Неэффективные соединения (остаток аминокислот, d-изомеры, NMDA и GABA) вызывали более мелкие устойчивые деполяризации, аналогичные ответам мутантов glr3.3 на Glu или Gly. Некоторые из этих ответов показаны на дополнительном рисунке S1B и в дополнительной таблице S1.Небольшие стойкие деполяризации, индуцированные Gln и Asp, были дополнительно исследованы, и было обнаружено, что они чувствительны к pH и не зависят от GLR3.3 (данные не показаны). Небольшие ответы, вызванные неэффективными аминокислотами, могут отражать протон-сопряженное поглощение соединений. Учитывая, что каждая из шести различных аминокислот индуцирует переходные процессы Ca ²⁺ и большую деполяризацию мембран, было выдвинуто предположение, что короткие пептиды, состоящие из одного или несколько из этих агонистов будут иметь аналогичные эффекты.Глутатион, распространенный трипептид в растениях, состоит из трех из шести эффективных аминокислот: Glu, Cys и Ser. Глутатион играет ряд важных ролей в метаболизме растений и ответах на стресс, отчасти из-за его способности обратимо окисляться и восстанавливаться (Noctor et al., 2002; Ogawa, 2005). Восстановленная форма глутатиона (GSH) деполяризовала клетки корня примерно на 100 мВ в зависимости от GLR3.3 (Таблица I; Рис. 4A

Рис. 4.

Глутатион активирует GLR3.3 активность в корнях. A, GSH (1000 мкм мкм) запускал большую временную деполяризацию мембраны у дикого типа, но не у мутантов glr3.3 . B, GSSG (1000 мкм мкм) вызвал меньшую, более широкую деполяризацию, которая также зависела от GLR3.3. Все показанные кривые мембранного потенциала представляют от трех до пяти независимых испытаний. C, GSH вызвал большое временное изменение цитозольного Ca ²⁺ ( n = 5). В соответствии с измерениями деполяризации, GSSG вызывал более медленный и меньший отклик Ca ²⁺, чем GSH ( n = 4).Значения SEM отображаются в произвольно выбранные моменты времени.

Рисунок 4.

Глутатион активирует активность GLR3.3 в корнях. A, GSH (1000 мкм мкм) запускал большую временную деполяризацию мембраны у дикого типа, но не у мутантов glr3.3 . B, GSSG (1000 мкм мкм) вызвал меньшую, более широкую деполяризацию, которая также зависела от GLR3.3. Все показанные кривые мембранного потенциала представляют от трех до пяти независимых испытаний. C, GSH вызвал большое временное изменение цитозольного Ca ²⁺ ( n = 5).В соответствии с измерениями деполяризации, GSSG вызывал более медленный и меньший отклик Ca ²⁺, чем GSH ( n = 4). Значения SEM отображаются в произвольно выбранные моменты времени.

). GSH также вызывает значительный переходный процесс Ca ²⁺ (рис. 4C). Окисленная форма глутатиона (GSSG) была намного менее эффективной, чем GSH, хотя ее действие также зависело от GLR3.3 (таблица I; рис. 4, B и C).

ОБСУЖДЕНИЕ

В почвах глютен образуется в результате разложения органических веществ и экссудатов, производимых живыми корнями (Lynch and Whipps, 1990; Nguyen, 2003; Jones et al., 2004). Его концентрация обычно находится в низком микромолярном диапазоне (Abuarghub, Read, 1988; Kielland, 1994; Jones et al., 2005). Исследование экссудации корней томатов ( Lycopersicon esculentum ) показало, что концентрация Glu в ризосфере составляет 9 μ m (Simons et al., 1997). Другие пять эффективных аминокислот также являются одними из самых распространенных в корневых выделениях и почвах. Например, Glu, Ala и Gly были среди четырех наиболее распространенных аминокислот, обнаруженных в корневых экссудатах кукурузы ( Zea mays ) (Kraffczyk et al., 1984). Метаболическое взаимодействие между микробами и корнями (Phillips et al., 2004; Singh et al., 2004; Somers et al., 2004) может динамически изменять концентрации аминокислот в ризосфере, тем самым производя химические сигналы, потенциально полезные для корня. На рис. 2 показано, что 10 мкл м Glu активировал GLR3.3, а на рис. 1В показано, что тот же самый низкий уровень агониста частично десенсибилизировал сигнальный механизм Ca ²⁺. Таким образом, GLR3.3 будет естественно встречаться с регуляторными концентрациями эффективных аминокислот.Это свидетельствует в пользу того, что GLR3.3-зависимый приток Ca ²⁺ является физиологически значимым, а не ложным фармакологическим эффектом. Способность GLR3.3 различать окисленные и восстановленные формы глутатиона повышает вероятность того, что он также может ощущать окислительно-восстановительное равновесие ризосферы.

Аминокислоты не только высвобождаются в ризосферу, но также присутствуют в апопласте всего растения. Одно исследование Arabidopsis показало, что активаторы GLR3.3 Glu, Ser и Asn входят в число четырех наиболее распространенных аминокислот в ксилеме корня и экссудатах листьев (Pilot et al., 2004). В экссудате листьев Glu составляет примерно 12% от общего количества аминокислот (Pilot et al., 2004). Следовательно, GLR-опосредованная ионная передача сигналов, опосредованная различными аминокислотами, может происходить между клетками по всему растению.

Необычайно широкий профиль агонистов GLR3.3 может отражать необычную структуру его внеклеточного аминоконца по сравнению с нейрональными глутаматными рецепторами (Turano et al., 2001). Недавний биоинформатический анализ аминокислотных связывающих мотивов в прокариотических и эукариотических геномах (Acher and Bertrand, 2005) обнаружил, что гены Arabidopsis GLR уникальны тем, что содержат два различных связывающих аминокислоты домена, гомологичных тем, которые обнаруживаются в бактериальных периплазматических связывающих белках.Вместе эти домены могут быть ответственны за активирующий эффект шести различных аминокислот и трипептида на GLR3.3-зависимый приток Ca ²⁺.

Широту профиля агонистов, обнаруженного здесь, трудно согласовать с выводом, что Glu связывается только с GLR1.1 и что Gly, вероятно, является эксклюзивным лигандом других 19 GLR (Dubos et al., 2003). Гомологическое моделирование растительных GLR-лиганд-связывающих доменов с использованием структур рецепторов глутамата животных в качестве матриц (Dubos et al., 2003) может быть недостаточно точным, чтобы точно предсказать лиганды. В качестве альтернативы, логика, используемая здесь для вывода агонистов, может быть чрезмерно расширена. Например, формально возможно, что обработка любой из шести эффективных аминокислот вызывает немедленное высвобождение истинного лиганда GLR3.3, так что в действительности то, что измеряется, является вторичным ответом на начальное лечение. Представленные здесь данные не являются убедительным доказательством того, что эффективные аминокислоты действительно связываются с GLR3.3. Они могут взаимодействовать с другим белком, который действует через GLR3.3, чтобы открыть проводимость Ca ²⁺. Тем не менее, очевидно, что GLR3.3-зависимые ионные потоки запускаются прямо или косвенно множеством аминокислот, которые естественным образом встречаются в эффективных концентрациях в ризосфере.

GLR3.3 опосредует управляемый аминокислотами приток Ca ²⁺ в корень, но не обязательно образует канал. Возможность того, что деполяризация мембраны из-за активации рецептора глутамата запускает приток Ca ²⁺ через отдельные, зависимые от напряжения каналы Ca ²⁺ (Courtney et al., 1990; White et al., 2002) был исследован с помощью эксперимента, который здесь не представлен. Концентрация внеклеточного K ⁺ была увеличена с 10 до 1000 мкм мкм, чтобы деполяризовать мембрану, но это не привело к обнаруживаемому увеличению Ca ²⁺, как сообщает экворин (данные не показаны). Несмотря на минимальное сходство последовательностей в поровых областях арабидопсиса и глутаматных рецепторов млекопитающих (Davenport, 2002), в настоящее время предпочтительной гипотезой является то, что GLR3.3 играет прямую роль в проведении Ca ²⁺ через плазматическую мембрану в ответ на амино кислоты.

Фенотип роста или развития, который помог бы связать GLR3.3-опосредованные потоки ионов с более высокой биологической функцией, не был идентифицирован у нокаут-мутантов, описанных здесь. Функциональная избыточность среди членов семейств генов является обычным объяснением отсутствия фенотипа, но это нелегко объяснить настоящий случай, потому что мутации glr3.3 по существу устраняют ионные ответы в изученных клетках. Другой член семейства, по-видимому, не компенсирует на уровне клеточной физиологии glr3.3 мутация в верхушке корня. В отличие от отсутствия очевидного внешнего фенотипа у glr3.3 , мутация гена OsGLR3.1 у риса ( Oryza sativa ; Li et al., 2006), очевидно, замедляла рост корней, нарушая меристематическую активность и жизнеспособность клеток на верхушке корня. Возможно, подобный фенотип будет наблюдаться у мутантов Arabidopsis glr3.3 , когда они культивируются в присутствии микроорганизмов или экссудатов, которые естественным образом активируют GLR3.3-зависимый Ca ²⁺ -сигнальный механизм.

Сигнальная система Ca ²⁺, опосредованная GLR3.3, может участвовать в ряде физиологических процессов, указанных в предыдущих исследованиях. Один из них — это уравновешивание метаболизма углерода и азота, на который в определенных условиях влияло антисмысловое подавление GLR1.1 (Kang and Turano, 2003). Кроме того, степень развития боковых корней пропорционально росту первичных корней зависит от микромолярных уровней Glu и, следовательно, может быть процессом, опосредованным GLR (Walch-Liu et al., 2006). Однако из эффективных аминокислот в Таблице I Glu была единственной, способной вызывать изменения архитектуры корня (Walch-Liu et al., 2006), что противоречит роли GLR3.3 в этой ответной реакции развития. Фармакологические данные указывают на роль GLR в индуцированном светом ингибировании роста гипокотилей (Lam et al., 1998). Считается, что цепи передачи сигналов, связывающие фоторецепторы с некоторыми стадиями этого процесса, включают потоки ионов, включая Ca ²⁺ (Spalding, 2000).Следовательно, подробные исследования фотоморфогенеза у проростков glr3.3 могут выявить фенотип. Роль GLR в питании Ca ²⁺ была предложена Kim et al. (2001), потому что сверхэкспрессия GLR3.2 привела к симптомам дефицита Ca ²⁺, но не к снижению уровней Ca ²⁺. Возможно, GLR3.3-опосредованная передача сигналов Ca ²⁺ играет роль в регуляции питания Ca ²⁺. Наконец, ответы на вредные элементы в ризосфере, такие как Al ³⁺, также могут зависеть от сигналов Ca ²⁺, опосредованных глутаматными рецепторами (Sivaguru et al., 2003). Одна привлекательная гипотеза гласит, что Al ³⁺ запускает высвобождение аминокислот, активирующих GLR3.3. Результирующее повышение Ca ²⁺ и связанное с ним изменение микротрубочек д. Приводить к наблюдаемому снижению скорости роста корней (Sivaguru et al., 2003).

Установление того, что GLR3.3 опосредует потоки ионов, включая большой приток Ca ²⁺ через плазматическую мембрану Arabidopsis, вызывает некоторые интригующие вопросы. Имеет химиочувствительный механизм прокариотического происхождения (Kuner et al., 2003) были сформированы эволюцией для удовлетворения потребностей корней в химиотерапии и коммуникационных потребностей центральной нервной системы? Консервированы ли в растениях компоненты передачи сигналов, которые функционируют ниже Glu-триггерных сигналов Ca ²⁺ в нейронах, таких как факторы транскрипции CREB (Ghosh and Greenberg, 1995)? Есть ли у растений система межклеточной коммуникации на основе Ca ²⁺, которая молекулярно гомологична механизму, лежащему в основе обучения? Опосредуют ли GLR межвидовую и внутривидовую передачу сигналов между корнями? Можно ожидать, что дальнейшая работа над молекулами GLR Arabidopsis и мутантами glr даст ответы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Рост растений

Семена

Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ) (экотип Columbia) стерилизовали поверхность 75% этанолом и высевали на вертикальные 0,7% агаровые чашки, содержащие 1 мМ KCl, 1 мМ CaCl. -Трис пропан. Планшеты выдерживали при 4 ° C в темноте от 48 до 72 часов перед переносом в камеру для выращивания с циклом фотопериода свет / темнота 16/8 часов и выращивали вертикально в течение 4-6 дней.

Измерение мембранного потенциала

Проростки поднимали с пластин для выращивания, устанавливали горизонтально на тонкий слой питательной среды, гелеобразной с 0,6% агаром, на дне записывающей камеры диаметром 3,5 см, затем покрывали тонким слоем ростовой среды без агара и давали возможность восстановиться за 3 ч. Измерения мембранного потенциала проводились, как описано ранее (Dennison and Spalding, 2000), за исключением того, что сбор данных в этом исследовании был достигнут с помощью аналого-цифрового преобразователя PCI-MIO-16XE-10 (National Instruments), управляемого с помощью специального программного обеспечения, написанного на Компьютерный язык Labview (National Instruments).Частота дискретизации составляла 20 Гц. Перфузия записывающей камеры (7 мл мин. ^-1) приводилась в действие перистальтическим насосом (Dynamax RP-1; Rainin) и контролировалась электронными клапанами. Исходный (контрольный) раствор для перфузии был таким же, как среда для выращивания (без агара), и его можно было заменить на среду с добавлением аминокислоты с помощью программного обеспечения для сбора данных. Было важно расположить впускную трубку как можно ближе к месту прокалывания, поскольку воспроизводимые электрофизиологические реакции требовали резкого (в течение примерно 2 с) обмена растворами.Эксперименты продолжались только в том случае, если был получен стабильный мембранный потенциал более отрицательного, чем -120 мВ.

Измерение внутриклеточного Ca

²⁺ с Aequorin

Семена растений, экспрессирующих экворин Arabidopsis, описанных ранее (Lewis et al., 1997), высевали и выращивали на чашках, как описано выше. Чтобы восстановить экворин с его субстратом, 4-дневные проростки переносили в темную комнату и при зеленом безопасном освещении помещали в питательную среду (без агара), за исключением содержащей 10 мкМ мкл коэлентеразина hcp (Molecular Probes) и позволяли замочить на ночь.Для каждого испытания пять проростков загружали в кювету люминометра, содержащую 200 мкл л питательной среды (без агара). Проросткам давали возможность восстановиться после обработки в темноте при 25 ° C в течение 2-4 часов. Программируемая быстрая доставка растворов агонистов в кювету осуществлялась встроенными инжекторами люминометра, использованного для регистрации сигнала экворина (TD-20/20; Turner Designs). Компьютер собирал данные с люминометра с частотой 5 Гц. Во время отдыха в темноте уровень люминесценции экворина, испускаемого пятью проростками, варьировал, но обычно составлял менее 100 относительных световых единиц.Вариабельность, вероятно, связана с разной степенью включения целентеразина и разным количеством ткани в кюветах. Обработка 1000 мкм мкм Glu вызвала быстрое увеличение люминесценции, обычно до тысяч относительных световых единиц. Статистический анализ показал, что существует сильная прямая корреляция между уровнем люминесценции экворина перед обработкой и пиковым ответом на агонист. Пробирки с более высоким уровнем экворина давали больший ответ, и корреляция была почти идеальной ( R ² = 0.98 для Glu, 0,99 для Gly). Поэтому для каждой отдельной кривой данные были разделены на средний фон (до обработки) люминесценции, что дало кратное увеличение кривой люминесценции экворина. Записи, нормализованные таким образом, показаны как трассы (например, дополнительный рисунок S1), усредненные трассы (например, рисунки 1B и 4C) или были интегрированы по времени, а затем усреднены (например, рисунок 1B, вставка).

Чтобы проверить влияние предварительной обработки Glu на последующую реакцию на высокие уровни Glu, проростки, экспрессирующие экворин, восстановленный с помощью целентеразина, предварительно обрабатывали указанной концентрацией Glu в течение 3 часов, а затем регистрировали их ответы на 1000 мкл мкл Glu, как описано выше.Для каждой концентрации перед обработкой Glu было проведено четыре независимых испытания. Чтобы проверить влияние увеличения внеклеточного Ca ²⁺ на реакцию на низкие уровни Glu (рис. 3C), проростки предварительно обрабатывали в течение 3-4 часов либо 1 мМ Ca ²⁺ ( n = 9). или 10 мМ Ca ²⁺ ( n = 8) перед обработкой такой же концентрацией Ca ²⁺ плюс 25 μ m Glu.

Измерение внутриклеточного Ca

²⁺ с YC2.1

Семена трансгенных растений, экспрессирующих желтый камелеон YC2.1 (Allen et al., 1999), были любезно предоставлены Саймоном Гилроем, Университет штата Пенсильвания. Проростки, выращенные в течение 4 дней, снимали с планшетов, устанавливали горизонтально на тонкий слой питательной среды, загущенной 0,6% агаром на дне записывающей камеры, погружали в среду для выращивания без агара и давали им возможность восстановиться в течение не менее 1 дня. час Если не указано иное, среда содержала 1 мМ CaCl ₂. Регистрирующую камеру устанавливали горизонтально на столик конфокального микроскопа Zeiss LSM 510 Meta.Кончики корней получали с помощью объектива Olympus LUMPlanFl × 40W, погруженного в раствор, омывающий корень. Возбуждение светом с длиной волны 458 нм осуществлялось аргоновым лазером мощностью 200 мВт. Усиленная флуоресценция голубого флуоресцентного белка (ECFP) и усиленный сигнал YFP (EYFP) на основе FRET собирали с помощью мета-детектора с использованием полосы пропускания от 462,6 до 484,0 нм и от 526,8 до 548,2 нм, соответственно. Участки эпидермальных и кортикальных клеток в зоне удлинения были выбраны в качестве области интереса и сканировались с интервалами примерно 600 мс.Для каждой временной точки были усреднены четыре отдельных сканирования, чтобы минимизировать шум. Раствор агониста вводили в камеру и удаляли из нее со скоростью приблизительно 2 мл мин ^-1 с использованием шприцевого насоса (SP120p; World Precision Instruments). Средние сигналы ECFP и EYFP определялись для ROI для каждого сканирования и использовались для получения кальций-зависимого отношения EYFP к ECFP.

Мутантное генотипирование

Семена линий растений, содержащих вставку Т-ДНК в интересующий ген, были получены из Института Солка (http: // signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress). Здесь использовались линии Salk_040458 ( glr3.3-1 , вставка второго экзона) и Salk_066009 ( glr3.3-2 , вставка первого интрона). Для выделения гомозиготных мутантных особей ДНК выделяли из образцов листьев и оценивали на наличие или отсутствие аллель-специфичных продуктов ПЦР. Целые листья помещали в 96-луночный планшет, содержащий хлороформ и буфер для экстракции (400 мМ Трис, pH 8,0; 480 мМ NaCl; 50 мМ ЭДТА, pH 8,0; 1% SDS) и измельчали с помощью измельчителя тканей (GenoGrinder 2000; Spex CertiPrep. ).После центрифугирования 1,200 г ДНК-содержащую фракцию дважды центрифугировали при 6,100 г , сначала в изопропаноле, а затем в промывке 80% этанолом. Осадок ДНК затем ресуспендировали в дистиллированной воде после сушки. Праймер Т-ДНК с левой границей (5′-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3 ‘) использовали в комбинации с ген-специфическими праймерами для проверки наличия или отсутствия аллелей вставки Т-ДНК в сегрегированных популяциях с использованием ПЦР и электрофореза в агарозном геле. Ниже приведены специфичные для генов праймеры, используемые для подтверждения генотипа обоих glr3.3 мутантных линии (SALK_040458 и SALK_066009): прямой 5′-GAA ACC AAA AGT TGT GAA AAT CGG T-3 ‘и обратный 5′-GAC ACA TTG TCT CTT AGG TGG GCC T-3’.

Дополнительные данные

В онлайн-версии статьи доступны следующие материалы.

Дополнительный рисунок S1. Обзор изменений мембранного потенциала и цитозольного Ca ²⁺ в ответ на l-изомеры 20 распространенных аминокислот и ГАМК.
Дополнительная таблица S1. Средние пиковые изменения мембранного потенциала и интегрированные сигналы экворина в ответ на каждую из распространенных аминокислот.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарны за растительный материал, предоставленный Центром биологических ресурсов арабидопсиса, и Натану Миллеру, Университет Висконсина, за создание программного обеспечения для сбора данных и устройства контроля перфузии.

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

Abuarghub SM, Read DJ (

1988

) Биология микоризы у вересковых.XII. Количественный анализ отдельных «свободных» аминокислот в зависимости от времени и глубины профиля почвы.

Новый Фитол

108

433

—

441

Acher FC, Bertrand HO (

2005

) Распознавание аминокислот доменами венериной мухоловки кодируется мотивом из 8 остатков.

Биополимеры

357

—

366

Allen GJ, Kwak JM, Chu SP, Llopis J, Tsien RY, Harper JF, Schroeder JI (

1999

) Индикатор кальция Cameleon сообщает о цитоплазматической динамике кальция в замыкающих клетках арабидопсиса.

Завод J

735

—

747

Boorer KJ, Frommer WB, Bush DR, Kreman M, Loo DDF, Wright EM (

1996

) Кинетика и специфичность переносчика H ⁺ / аминокислота из Arabidopsis thaliana .

J Biol Chem

271

2213

—

2220

Chiu J, DeSalle R, Lam H-M, Meisel L, Coruzzi G (

1999

) Молекулярная эволюция рецепторов глутамата: примитивный сигнальный механизм, существовавший до расхождения растений и животных.

Mol Biol Evol

826

—

838

Courtney MJ, Lambert JJ, Nicholls DG (

1990

) Взаимодействие между деполяризацией плазматической мембраны и активацией рецептора глутамата в регуляции цитоплазматического свободного кальция в культивируемых гранулярных клетках мозжечка.

J Neurosci

3873

—

3879

Давенпорт Р. (

2002

) Глутаматные рецепторы у растений.

Энн Бот (Лондон)

549

—

557

Демидчик В., Эссах П., Тестер М (

2004

) Глутамат активирует катионные токи в плазматической мембране клеток корня Arabidopsis .

Planta

219

167

—

175

Деннисон К.Л., Сполдинг Е.П. (

2000

) Глутаматные кальциевые потоки у Arabidopsis.

Plant Physiol

124

1511

—

1514

Дингледин Р., Борхес К., Боуи Д., Трейнелис С.Ф. (

1999

) Ионные каналы рецептора глутамата.

Pharmacol Rev

—

Dubos C, Huggins D, Grant GH, Knight MR, Campbell MM (

2003

) Роль глицина в блокировании растительных NMDA-подобных рецепторов.

Завод J

800

—

810

Этертон Б., Рубинштейн Б. (

1978

) Доказательства совместного транспорта аминокислоты-H ⁺ в колеоптилях овса.

Plant Physiol

933

—

937

Фишер В. Н., Андре Б., Рентч Д., Кролкевич С., Тегедер М., Брейткройц К., Фроммер В. Б. (

1998

) Транспорт аминокислот в растениях.

Trends Plant Sci

188

—

195

Гош А., Гринберг М. Е. (

1995

) Передача сигналов кальция в нейронах — молекулярные механизмы и клеточные последствия.

Наука

268

239

—

247

Hepler PK (

2005

) Кальций: центральный регулятор роста и развития растений.

Растительная ячейка

2142

—

2155

Hetherington AM, Brownlee C (

2004

) Генерация сигналов Ca ²⁺ в растениях.

Анну Rev Plant Biol

401

—

427

Jones DL, Shannon D, Junvee-Fortune T, Farrarc JF (

2005

) Улавливание свободных аминокислот растениями максимально увеличивается при высоких концентрациях аминокислот в почве.

Soil Biol Biochem

179

—

181

Джонс Д.Л., Ходж А., Кузяков Ю. (

2004

) Растения и микоризная регуляция ризодепозиции.

Новый Фитол

163

459

—

480

Джонс М.В., Вестбрук Г.Л. (

1996

) Влияние десенсибилизации рецептора на быструю синаптическую передачу.

Trends Neurosci

—

101

Kang J, Turano FJ (

2003

) Предполагаемый рецептор глутамата 1.1 (AtGLR1.1) функционирует как регулятор углеродного и азотного метаболизма у Arabidopsis thaliana .

Proc Natl Acad Sci USA

100

6872

—

6877

Kielland K (

1994

) Поглощение аминокислот арктическими растениями: последствия для питания растений и круговорота азота.

Экология

2373

—

2383

Kim SA, Kwak JM, Jae S-K, Wang M-H, Nam HG (

2001

) Сверхэкспрессия гена AtGluR2 , кодирующего гомолог рецепторов глутамата млекопитающих Arabidopsis, ухудшает утилизацию кальция и чувствительность к ионному стрессу у трансгенных растений.

Физиология растительных клеток

—

Kinraide TB, Etherton B (

1980

) Электрические доказательства различных механизмов поглощения основных, нейтральных и кислых аминокислот в колеоптилях овса.

Plant Physiol

1085

—

1089

Kinraide TB, Etherton B (

1982

) Энергетическая связь в котранспорте H ⁺ -аминокислоты: АТФ-зависимость спонтанной электрической реполяризации клеточных мембран в колеоптилях овса.

Plant Physiol

648

—

652

Kraffczyk I, Trolldenier G, Beringer H (

1984

) Растворимые корневые экссудаты кукурузы: влияние поступления калия и ризосферных микроорганизмов.

Soil Biol Biochem

315

—

322

Kuner T, Seeburg PH, Guy HR (

2003

) Общая архитектура для каналов K ⁺ и ионотропных рецепторов глутамата?

Trends Neurosci

—

Лакомб Б., Беккер Д., Хедрих Р., ДеСалле Р., Холлман М., Квак Дж. М., Шредер Д. И., Новер Н. Л., Нам Х. Г., Сполдинг Е. П. и др. (

2001

) Идентичность рецепторов глутамата растений.

Наука

292

1486

—

1487

Lam H-M, Chiu J, Hsieh M-H, Meisel L, Oliveira IC, Shin M, Coruzzi G (

1998

) Гены глутаматных рецепторов в растениях.

Природа

396

125

—

126

Lemtiri-Chlieh F, Berkowitz GA (

2004

) Циклический аденозинмонофосфат регулирует кальциевые каналы в плазматической мембране защитных клеток листьев арабидопсиса и клеток мезофилла.

J Biol Chem

279

35306

—

35312

Lewis BD, Karlin-Neumann G, Davis RW, Spalding EP (

1997

) Ca ²⁺ -активированные анионные каналы и деполяризации мембран, вызванные синим светом и холодом у проростков арабидопсиса.

Plant Physiol

114

1327

—

1334

Li J, Zhu SH, Song XW, Shen Y, Chen HM, Yu J, Yi KK, Liu YF, Karplus VJ, Wu P и др. (

2006

) Ген, подобный рецептору глутамата риса, имеет решающее значение для деления. и выживаемость отдельных клеток в апикальной меристеме корня.

Растительная ячейка

340

—

349

Линч Дж. М., Уиппс Дж. М. (

1990

) Течение субстрата в ризосфере.

Растительная почва

129

—

Мэдден Д. (

2002

) Структура и функция ионных каналов рецептора глутамата.

Nature Rev Neurosci

—

101

Мейерхофф О., Мюллер К., Роэльфсема М.Р., Латц А., Лакомб Б., Хедрих Р., Дитрих П., Беккер Д. (

2005

) AtGLR3.4, подобный каналу ген рецептора глутамата чувствителен к прикосновениям и холоду.

Planta

222

418

—

427

Нгуен С. (

2003

) Ризоразложение органического углерода растениями: механизмы и меры контроля.

Agronomie (Париж)

375

—

396

Noctor G, Gomez L, Vanacker H, Foyer CH (

2002

) Взаимодействия между биосинтезом, компартментацией и транспортом в контроле гомеостаза глутатиона и передачи сигналов.

J Exp Bot

1283

—

1304

Огава К. (

2005

) Глутатион-ассоциированная регуляция роста растений и реакции на стресс.

Антиоксидный окислительно-восстановительный сигнал

973

—

981

Peiter E, Maathuis FJM, Mills LN, Knight H, Pelloux M, Hetherington AM, Sanders D (

2005

) Вакуолярный Ca2 + -активированный канал TPC1 регулирует прорастание и движение устьиц.

Природа

434

404

—

408

Phillips DA, Fox TC, King MD, Bhuvaneswari TV, Teuber LR (

2004

) Микробные продукты вызывают экссудацию аминокислот из корней растений.

Plant Physiol

136

2887

—

2894

Pilot G, Stransky H, Bushey DF, Pratelli R, Ludewig U, Wingate VPM, Frommer WB (

2004

) Сверхэкспрессия глутамина dumper1 приводит к гиперсекреции глутамина из гидатодов листьев Arabidopsis.

Растительная ячейка

1827

—

1840

Сандерс Д., Пеллу Дж., Браунли С., Харпер Дж. Ф. (

2002

) Кальций на перекрестке сигнальных путей.

Plant Cell (Suppl)

S401

–S417

Simons M, Permentier HP, de Weger LA, Wijffelman CA, Lugtenberg BJJ (

1997

) Синтез аминокислот необходим для колонизации корней томатов штаммом Pseudomonas fluorescens WCS365.

Mol Plant Microbe Interact

102

—

106

Сингх Б.К., Миллард П., Уайтли А.С., Муррелл Дж. К. (

2004

) Распутывание ризосферно-микробных взаимодействий: возможности и ограничения.

Trends Microbiol

386

—

393

Сивагуру М., Пайк С., Гассманн В., Баскин Т.И. (

2003

) Алюминий быстро деполимеризует кортикальные микротрубочки и деполяризует плазматическую мембрану: доказательства того, что эти ответы опосредуются рецептором глутамата.

Физиология растительных клеток

667

—

675

Somers E, Vanderleyden J, Srinivasan M (

2004

) Бактериальная сигнализация ризосферы: парад любви у нас под ногами.

Crit Rev Microbiol

205

—

240

Spalding EP (

2000

) Ионные каналы и преобразование световых сигналов.

Среда растительных клеток

665

—

674

Turano FJ, Panta GR, Allard MW, van Berkum P (

2001

) Предполагаемые рецепторы глутамата растений связаны с двумя суперсемействами рецепторов нейротрансмиттеров животных посредством различных эволюционных механизмов.

Mol Biol Evol

1417

—

1420

Véry A-A, Sentenac H (

2002

) Катионные каналы в плазматической мембране Arabidopsis .

Trends Plant Sci

168

—

175

Walch-Liu P, Liu LH, Remans T., Tester M, Forde BG (

2006

) Доказательства того, что L-глутамат может действовать как экзогенный сигнал для модуляции роста и ветвления корня у Arabidopsis thaliana .

Физиология растительных клеток

1045

—

1057

White PJ, Bowen HC, Demidchik V, Nichols C, Davies JM (

2002

) Гены для проницаемых для кальция каналов в плазматической мембране клеток корней растений.

Biochim Biophys Acta

1564

299

—

309

Заметки автора

© Автор (ы) 2006.Опубликовано Oxford University Press от имени Американского общества биологов растений. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинальная работа правильно процитировано.

Полимеры | Бесплатный полнотекстовый | Понимание биосинтеза бактериальной целлюлозы из различных источников углерода и связанных путей биохимической трансформации у Komagataeibacter sp.W1

3.1. Производство ЧУ из различных источников углерода

Производство ЧУ в микроорганизмах — интересная черта, поскольку этот процесс требует много энергии для производства биоматериалов, а не приводит к размножению клеток [31]. Возможные цели производства БК — приобретение кислорода, предотвращение ультрафиолетового повреждения, повышение устойчивости к антибиотикам, удержание влаги и поддержание взаимодействия бактерий-хозяев [32,33,34]. Поскольку глюкоза является предшественником синтеза целлюлозы, все соединения, которые могут быть преобразованы в глюкозу, способны продуцировать BC.Выбор углеродных подложек — одно из основных требований для эффективного производства ЧУ [34]. Основываясь на нашем предыдущем исследовании [3], интерес здесь в этом исследовании состоял в том, чтобы оценить потенциал штамма W1 в использовании различных источников углерода и последующем производстве BC. После 14 дней инкубации при 30 ° C, BC на поверхности среды, содержащие ацетат, этанол, фруктозу, глюкозу, глицерин, лактозу, маннит и сахарозу, собирали и предварительно обрабатывали, как описано ранее (подробности см. в разделе 2.2). Как показано на Рисунке 1, все восемь источников углерода, использованных в этом исследовании, образовали СУ; среди которых фруктоза, глюкоза, глицерин и маннит давали толстые мембраны, а другие образовывали нерегулярные и тонкие мембраны (рис. 1А). После сублимационной сушки мембраны, полученные из фруктозы, глюкозы, глицерина и маннита, имели гладкую поверхность и хорошие механические свойства типичных БК, как и сахарозы, хотя содержание мембран в этой группе было намного ниже, чем в первых. (Рисунок 1B).Однако высушенные мембраны BC, полученные из ацетата, этанола и лактозы, были хрупкими и прочными (рис. 1B), что указывает на то, что состав и структура BC могут отличаться. Для сравнения производительности BC были взвешены и рассчитаны выходы. . Подобно результатам, полученным на Рисунке 1A, B, более высокие веса BC наблюдались в группах фруктозы, глюкозы, глицерина и маннита, в диапазоне от 1,125 до 1,529 г на л ^-1 (Рисунок 1C). Значения были в 5,9–38 раз выше, чем в средах, содержащих ацетат, этанол, лактозу или сахарозу (≤0.190 г л ⁻¹; Рисунок 1С). Соответственно, штамм W1 преобразовал 0,20–7,65% источников углерода в BC (рис. 1C), из которых содержание фруктозы было значительно выше, чем содержание глюкозы, глицерина и маннита (p ≤ 0,05; рис. 1C). Аналогичным образом наблюдались очевидные различия в других источниках углерода (рис. 1C), что позволяет предположить, что способность штамма W1 использовать различные источники углерода значительно различалась. Чтобы сделать сопоставимую оценку продуктивности BC у штамма W1, источники углерода, используемые для производства BC и выходы BC в репрезентативных бактериальных штаммах были суммированы (Таблица 1).Среди зарегистрированных источников углерода глюкоза, фруктоза и маннитол лучше всего подходят для производства ЧУ, что согласуется с нашими выводами (Таблица 1; Рисунок 1). Однако в некоторых случаях бактерии-продуценты БЦ предпочитают использовать сахарозу, лактозу или смесь ксилозы и ксилулозы, в то время как другие источники углерода имеют ограниченное применение для производства БК (Таблица 1). Одна из возможных причин заключается в том, что как структурные изомеры глюкозы (например, фруктозы), так и предшественники глюкозы (например, глицерин и маннит) легко превращаются в глюкозу и вступают в циклы фосфорилирования глюкозы, изомеризации глюкозо-6-фосфата, Синтез UDP-глюкозы и удлинение с образованием BC [35].В отличие от структурной изомеризации или сплайсинга малых молекул, ферментативное расщепление дисахаридов также является хорошей стратегией для производства глюкозы (Рисунок S1), что объясняет, почему некоторые бактерии обладают высокой эффективностью в использовании сахарозы и лактозы для производства БК [12,36]. Интересно, что штамм W1 был единственным продуцентом, который предпочел использовать фруктозу среди родов Acetobacter, Gluconacetobacter и Komagataeibacter (Таблица 1). Фактически, этот признак часто встречается у других родов, таких как Enterobacter [37] и Rhodococcus [38].Хотя штамм W1 не обладал большой способностью использовать источники углерода для производства ЧУ (0,015–0,547% в день ^-1; Таблица 1) по сравнению с другими продуцентами ЧУ, его предпочтение в отношении использования фруктозы могло бы предоставить полезную информацию для дальнейших исследований. Также стоит отметить, что среда с добавлением маннита часто давала более высокий BC, чем среда с глюкозой [13,39,40], с самым высоким выходом 9,58% в день ^-1 (Таблица 1). Это отличается от точки зрения, согласно которой глюкоза считается основным источником продукции БК [14,16].Кроме того, для определенного штамма урожайность ЧУ при разных условиях культивирования сильно различается. Например, G. xylinus PTCC 1734 имеет относительную урожайность 0,947% в день ^-1 в условиях перемешивания, но выросла до 2,5% в день ^-1 в статических условиях (Таблица 1), что свидетельствует о значительном влиянии методов культивирования. по производству БК [12]. Между двумя вышеуказанными условиями наиболее подходящими источниками углерода для производства ЧУ были сахароза и маннит, соответственно (Таблица 1).Что касается урожайности СУ с различными штаммами K. xylinus (ранее A. xylinus или G. xylinus), то данные варьируются от 0,071% до 5,29% в день ^-1 (Таблица 1). Вышеупомянутые наблюдения показывают, что не существует аналогичной модели поведения бактерий для использования источников углерода для производства СУ, выбор наиболее подходящего источника углерода для производства СУ в отдельном штамме очень важен [41]. В нашем исследовании все использованные источники углерода были сахара, за исключением ацетата и этанола, которые являются хорошо известными субстратами, ответственными за усиление продукции АТФ и ингибирование процессов продукции анти-BC [17].Исследования, посвященные добавлению ацетата и (или) этанола и их последующему влиянию на производство БК, хорошо задокументированы [17,18,19,20]. Хотя в некоторых исследованиях пытались получить СУ с использованием ацетата или этанола в качестве единственного источника углерода, выход СУ намного ниже, чем для сахаров [16,36]. Это было подтверждено нашим исследованием (рис. 1C; таблица 1), подразумевающим, что и ацетат, и этанол в основном служат усилителями, продуцирующими BC, а не непосредственно превращаются в BC.

3.2. BC Морфология и анализ микрофибрилл с помощью SEM Observation

Морфология и структурные характеристики мембран BC, производимых Komagataeibacter sp.W1 из различных источников углерода оценивали с помощью SEM. Как видно на Рисунке 2A – H, все источники углерода, использованные в этом исследовании, давали пленки BC с плотной морфологией. Наши результаты были аналогичны штаммам K. xylinus KX, TISTR 086, 428, 975, 1011 и B-12068 [12,47], но отличались от K. medellinensis и K. xylinus CH001 [2,19], последние два производили менее плотная сеть микрофибрилл с высокой пористостью до 60%. Это указывает на то, что разные бактерии или бактериальные штаммы могут иметь разный узор переплетения для образования БК.Из-за неразличимых различий в морфологии BC мы также рассчитали распределение диаметров BC с помощью Nano Measurer 1.2 на основе изображений SEM. Результаты показали, что все источники углерода могут производить микрофибриллы размером 30 нм или меньше со средним диаметром 40–50 нм, за исключением этанола (рис. 2a – h). Наши данные соответствуют исследованию Volova et al. [47], предполагая, что небольшие микрофибриллы также, вероятно, были связаны с более низкой плотностью BC, как описано ранее. Было очевидно, что видимым компонентом BC в нашем исследовании были ленты целлюлозы (часто 40-60 нм), а не нанофибриллы, потому что диаметр субэлементарных фибрилл составляет 3-4 нм [49,50].Хотя внешний вид СУ, полученных из ацетата, этанола, лактозы и сахарозы, отличался от других субстратов (рис. 1), и визуализация с помощью СЭМ, и анализ распределения диаметров подтвердили, что все источники углерода, использованные в этом исследовании, давали типичные СУ (рис. 2). Однако причины, влияющие на эффективность производства ЧУ у Komagataeibacter sp. W1 по-прежнему требует дальнейшего расследования.

3.3. Кристаллические различия мембран BC, полученных из различных источников углерода

Хорошо известно, что BC представляет собой гомогенное поликристаллическое макромолекулярное соединение, состоящее из упорядоченных кристаллических и менее упорядоченных аморфных областей [51].Для определения кристаллической структуры и кристаллического содержания BC все образцы были проанализированы методом XRD. На рис. 3 показано, что разные источники углерода приводят к разным дифракционным профилям. В частности, BC, полученные из фруктозы, глюкозы, глицерина и маннита, показали два типичных пика при 2θ 14,5 ° и 22,7 ° с сильной интенсивностью и слабым пиком при 2θ 16,6 ° (рис. 3c – e, g). В то время как два широких пика были отнесены к плоскостям (100) и (110) целлюлозы I _α или (11¯0) и (200) плоскостям целлюлозы I _β, соответственно, слабый пик указывал на присутствие (010) плоскость целлюлозы I _α или плоскость (110) целлюлозы I _β (рисунок 3) [52].Более высокая интенсивность пика 14,5 °, чем пика 16,6 °, показала, что содержание I _α было выше, чем I _β [53], а форма кристаллитов целлюлозы была прямоугольной, а не квадратно-поперечной. секционный [51], что согласуется со случаями Singhsa et al. [12] и Кешк и Самешима [54]. Интересно отметить, что, хотя ацетат и этанол производили ограниченное количество БК, они показали картину рентгеновской дифракции, аналогичную БК, полученной из вышеупомянутых сахаров (рис. 3a, b).Однако на мембранах BC, полученных из лактозы и сахарозы, наблюдался только один слабый пик (рис. 3f, h). При 2θ 28,6 ° слабый пик был обнаружен в ацетатной и глицериновой группах, о котором почти не сообщалось и который требует дальнейших исследований (рис. 3a, e). Наши данные показали, что все источники углерода могут производить BC с высокой кристалличностью, за исключением лактозы и сахарозы. Как показано в таблице 2, межплоскостное расстояние между кристаллами (то есть d-расстояние) каждого пика большинства BC было одинаковым, если предположить, что пик сдвигается при 2θ на 14.5 ^o не встречались, и разные БК имели одинаковое содержание целлюлозы I _α [23]. Из-за отсутствия пика (100 _Iα) или (11¯0 _Iβ) в группе лактозы и пика (010 _Iα) или (110 _Iβ) в группах этанола, лактозы и сахарозы, все соответствующие d-интервалы и ACS отсутствовали (Таблица 2). Однако, в отличие от d-интервала, ACS значительно различалась в разных группах (таблица 2). Например, ACS пика 1 для фруктозы, глюкозы, глицерина и маннита были аналогичными — 7.9–8,8 нм, которое уменьшилось до 6,7–6,9 нм в ацетате и этаноле и увеличилось до 23,6 нм в сахарозе (таблица 2). Более низкие или более высокие значения ACS в ацетате, этаноле, лактозе и сахарозе могут быть отнесены к нерегулярным тканевым структурам микрофибрилл BC (Рисунок 1 и Рисунок 2). Подобно пику 1, большинство BC имели типичный ACS в пике 3, но ACS в лактозе и сахарозе были намного ниже, чем в других (Таблица 2). Однако, поскольку пик 2 был слабым, соответствующие ACS не следовали аналогичным тенденциям, как для пика 1 и пика 3 (рис. 3; таблица 2), что снова подтвердило высокое содержание I _α во всех группах, как описано ранее.Помимо d-spacing и ACS, мы также определили C.I. и% кристалличности образцов СУ, полученных из различных источников углерода. В целом, C.I. варьировала от 0,64 до 0,89, самая высокая и самая низкая — для маннита и лактозы, соответственно (таблица 2). Соответственно, все БК имели высокую кристалличность от 83 до 90%, за исключением 73% для лактозы и 74% для сахарозы, соответственно (Таблица 2). Это следовало тем же тенденциям, что и для d-интервала и ACS (таблица 2), но отличалось от выхода BC (рисунок 1). Более того, наши данные показали кристалличность, подобную той, что сообщается в предыдущих исследованиях [2,14,23].В большинстве случаев более низкая ACS соответствовала более высокой кристалличности BC (Таблица 2), что было подтверждено недавним исследованием Meza-Contreras et al. [55]. Поскольку пик, соответствующий плоскости решетки (200), часто показывает самую высокую интенсивность на дифрактограммах природного БУ (рис. 3) и играет важную роль в более высокой кристалличности и меньшем размере кристаллитов [19], маннит может быть идеальным источником углерода. для производства СУ в Komagataeibacter sp. W1.

3.4. Функциональные группы и характеристика типов целлюлозы на основе анализа FTIR

FTIR-спектры BC, полученных из различных источников углерода, показаны на рисунке 4.Хотя разные источники углерода привели к большим различиям в выходах СУ (рис. 1С), а рентгенограммы СУ также значительно различались (рис. 3), все ИК-Фурье-спектры показали несколько типичных полос колебаний с небольшой разницей (рис. 4), что означает одинаковую химическую структуру. для разных СУ, полученных из разных источников углерода [2]. Из 22 пиков большинство было отнесено к определенным функциональным группам в предыдущих исследованиях. Например, несколько типичных адсорбций, связанных с растяжением O – H примерно при 3345 см ^-1, растяжением C – H примерно при 2900 см ^-1, растяжением антисимметричного мостика C – O – H 1,4-β-глюкозида примерно на 1160 см ^-1 и антисимметричное противофазное растяжение кольца β-глюкозидных связей между глюкозными единицами примерно на 900 см ^-1 (Фиг.4; Таблица 3).Аналогичным образом, мы также обнаружили другие адсорбции из-за изгиба O – H на уровне около 1360, 1280 и 1205 см ⁻¹, изгиба O – H в плоскости около 1430 и 1335 см ⁻¹, изгиба C − O на около 1108, 1055 и 1031 см ⁻¹, и изгиб O – H в противофазе при волновых числах ниже 660 см ⁻¹ (Рисунок 4; Таблица 3). Однако адсорбции при 1430, 1335, 1108, 1055 и 1031 см ^-1 также можно отнести к симметричному изгибу CH ₂, деформации C – H, связям C – C мономерных звеньев полисахарида и C Скелетные колебания –O – C пиранозного кольца соответственно (табл. 3).Наше исследование показало, что БК, произведенные Komagataeibacter sp. W1 в основном состояли из целлюлозы I (адсорбция на примерно 3345, 1430, 1160 и 900 см ^-1) с небольшим количеством целлюлозы II (адсорбция примерно на 1335, 1315 и 1280 см ^-1 и синее смещение волновое число от 1430 до 1425 см (^-1) (Таблица 3) [3]. Как отмечалось ранее, определение характеристик BC часто выполняется с использованием методов XRD и ¹³ C-ЯМР [46,55,56]. Однако из-за перекрытия отражений целлюлозы I _α и I _β трудно различить два алломорфа, только определяя положения пиков XRD [12].Молина-Рамирес и др. [2] показали, что FTIR может помочь отличить алломорф I _α (около 3240 и 750 см ^-1) от алломорфа I _β (около 3270 и 710 см ^-1). Фракции I _α БК, полученные из фруктозы, глюкозы и сахарозы у K. medellinensis, составляли от 0,70 до 0,74 [2], что было выше, чем у A. xylinus 23769 на 0,36–0,43 [23], штаммов A. xylinus ATCC 10245, IFO 13693, IFO13772, IFO13773, IFO14815 и IFO15237 из 0,38–0,43 [54] и Komagataeibacter sp.W1 0,51 для всех групп в нашем исследовании. Однако наши данные согласуются с хорошо известным фактом, что для I _α она составляет около 64% в BC [57]. Мы предположили, что штамм W1 обладал способностью продуцировать оба алломорфа одновременно, а способность продуцировать I _α и I _β была стабильной независимо от источников углерода с добавками.

3,5. Понимание биохимических путей использования источников углерода и синтеза BC

В микроорганизмах несколько метаболических пулов участвуют в биосинтезе BC.Одним из прямых путей производства BC является предварительное образование гексозофосфата путем фосфорилирования экзогенных гексоз [35]. С этой целью изомеры фруктозы и глюкозы являются идеальными источниками углерода для производства BC, что подтверждается нашими выводами (Рисунок 1 и Рисунок S1). Что касается других источников углерода, то преобразование в две вышеупомянутые гексозы является первым и важным шагом для производства БЦ через пентозный цикл и глюконеогенный путь [58]. Помимо физиобиохимических наблюдений и оценки синтеза БЦ в микроорганизмах, также важно понимать метаболическую сеть источников углерода [41].Однако об этом почти не сообщается в существующих исследованиях. В нашем предыдущем исследовании была получена информация о геноме штамма W1 и аннотированы некоторые ассоциированные ферменты в трансформации глюкозы и синтезе BC [3]. Чтобы изучить, как штамм W1 утилизирует другие источники углерода, а затем производит BC, это исследование также суммировало orfs, ответственные за метаболизм различных источников углерода и производство BC. Как показано на Фигуре 5 и Таблице S1, штамм W1 имел 157 orf, соответствующих различным метаболизмам источников углерода, большинство из которых были изучены в этой работе, за исключением маннозы, гликогена / крахмала и трегалозы.Фактически, помимо тех orfs, ответственных за кодирование ферментов, участвующих в прямой трансформации глюкозы и синтезе и регуляции целлюлозы, мы также обнаружили больше косвенных orfs, нацеленных на эти процессы (Таблица S1). В целом, у штамма W1 было 27 orf, связанных с метаболизмом алкоголя (этанола), что было самым высоким среди 11 групп, за которым следовали метаболизм глюкозы 24 и метаболизм глицерина 22 (рис. 5). Это было понятно, потому что штамм W1 был уксусной бактерией, используемой для производства уксуса (метаболизм алкоголя), и типичным продуцентом BC (метаболизм глюкозы) [3].В отличие от обычных углеродных субстратов, глицерин не только может превращаться в глюкозу, он также легко разлагается и используется в качестве источника энергии для улучшения цикла TCA [23,24,41]. Интересно отметить, что оба orfs, соответствующие метаболизму фруктозы и маннита, были меньше, чем для других, за исключением трегалозы и гликогена / крахмала (Рисунок 5). По-видимому, количество orfs не соответствовало тенденции продуктивности BC, как описано ранее (рис. 1C), предполагая, что на метаболизм источника углерода также могут влиять другие факторы, такие как ферментативная активность, предпочтение субстрата и метаболические потоки [2,59] .Чтобы иметь полное представление о метаболизме источника углерода и продукции BC в штамме W1, мы дополнительно предоставили обзор orfs, которые могут быть аннотированы для определенных путей KEGG (Рисунок 5; Таблица S2). На основе анализа сочетания пути orfs-KEGG, схематическая диаграмма метаболизма источника углерода и путей биосинтеза BC у Komagataeibacter sp. W1 также были предоставлены (Рисунок 6). Как и ожидалось, большинство orfs могут быть аннотированы для определенного пути KEGG (рисунок 5), и все соответствующие ферменты приведены в таблице S2 и обозначены на рисунке 6.В частности, фруктоза, маннит и глицерин могут ферментативно превращаться в глюкозу, а затем продуцировать БК через пентозофосфатный путь или путь глюконеогенеза [59], но лактоза и сахароза этого не делают (рис. 6). Хотя ацетат и этанол были способны генерировать ацетилкофермент A (ацетил-КоА) и функционировали в цикле TCA и трансформации глицерина, мы не обнаружили никакого возможного пути, связывающего их с глюкозой или другими сахарами (рис. 6). Поскольку глюкоза из среды удалялась перед переносом посевного раствора, было возможно, что и ацетат, и этанол не были предшественниками глюкозы, а небольшое количество BC, наблюдаемое в нашем исследовании, могло быть связано с высвобождением глюкозы из клеток и последующим образованием BC (рис. 1).Мы также заметили, что глицерин, маннит и фруктоза имеют два пути (т. Е. Пируватный путь и глицерат-фосфатный путь) для производства оксалоацетата и вступления в цикл TCA [24], тем самым увеличивая выработку энергии и использование источников углерода для производства BC (рис. 1 и рисунок 6). Однако наши результаты отличались от результатов Molina-Ramírez et al. [2] в том, что глюкоза получила BC на 86% выше, чем фруктоза, что снова показывает, что разные бактериальные штаммы имеют разные характеристики в отношении использования источника углерода и производства BC (Таблица 1).

терапевтических лигандов противодействуют функции рецепторов эстрогенов, нарушая их подвижность ER в раковых клетках

•

«Деструкторы ER» запускают взаимодействие ER с ДНК в канонических сайтах связывания

•

Влияние на доступность хроматина отличает антагонисты ER от слабых активаторов

•

Dramatic замедление подвижности ER вызывает антагонизм ER и предшествует обороту ER

Резюме

Рак молочной железы, положительный по рецепторам эстрогена (ER ⁺), часто остается зависимым от передачи сигналов ER даже после приобретения устойчивости к эндокринным агентам, что способствует развитию оптимизированных Антагонисты ER.Фулвестрант является уникальным среди одобренных ER терапевтических средств из-за его способности к полному антагонизму ER, который, как считается, достигается за счет деградации ER. Клинический потенциал фулвестранта ограничен плохими физико-химическими характеристиками, что стимулирует попытки создать деструкторы ER с улучшенными лекарственными свойствами. Мы показываем, что оптимизация деградации ER не гарантирует полного антагонизма ER в клетках рака груди; «Деструкторы» ER проявляют спектр транскрипционной активности и антипролиферативный потенциал.Механически мы обнаружили, что антагонисты, подобные фулвестранту, подавляют транскрипционную активность ER не за счет элиминации ER, а за счет заметного замедления внутриядерной подвижности ER. Повышенный оборот ER происходит как следствие иммобилизации ER. Эти находки подтверждают концепцию того, что нарушение подвижности факторов транскрипции небольшими молекулами может способствовать терапевтическому нацеливанию на этот сложный класс мишеней.

Ключевые слова

рак груди

рецептор эстрогена

фулвестрант

селективный подавитель ER

SERD

транскрипция

иммобилизация

хроматин

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0) 2019 Else

Inc.

Цитирующие статьи

Вредные мутации в малой субъединице рибосомной РНК определяют функциональные сайты и потенциальные мишени для антибиотиков

Ясин и др. . 10.1073 / pnas.0508444102.

Вспомогательная информация

Файлы в этом Дополнении к данным:

Вспомогательные материалы и методы
Вспомогательная таблица 1
Вспомогательный фильм 1
Вспомогательный рисунок 4
Вспомогательный рисунок 5
Вспомогательный рисунок 6
Вспомогательный рисунок 7
Вспомогательный рисунок 8
Вспомогательный рисунок 9

Рис.4. Мутации в сайтах действия известных антибиотиков (фиолетовый) и в сайтах, не нацеленных на исследуемые препараты (желтый). Мутации относились к сайтам связывания антибиотика, если они располагались в пределах 6 Å от сайта связывания антибиотика с рибосомной субъединицей Thermus aquaticus 30S в кристаллическом состоянии (1-3).

1. Бродерсен Д. Э., Клемонс В. М. мл., Картер А. П., Морган-Уоррен Р. Дж., Уимберли Б. Т. и Рамакришнан В. (2000) Cell 103, 1143–1154.

2. Картер А. П., Клемонс, В. М., Бродерсен, Д. Э., Морган-Уоррен, Р. Дж., Уимберли, Б. Т. и Рамакришнан, В. (2000) Nature 407, 340–348.

3. Пиолетти, М., Шлунцен, Ф., Хармс, Дж., Заривач, Р., Глуманн, М., Авила, Х., Башан, А., Бартельс, Х., Ауэрбах, Т., Якоби , C., et al. (2001) EMBO J. 20, 1829–1839.

Рис. 5. Распределение мутаций между известными функциональными сайтами (оранжевый) и сайтами менее известной функциональной значимости (синий).Считается, что мутация принадлежит функциональному сайту, если она является частью элемента рРНК, участвующего в соответствующей функции рибосомы. Возможная функциональная роль положений нуклеотидов, указанных в таблице, взята из ссылок. 1–6. Также показаны ранее идентифицированные вредные мутации (7): серые, если они отсутствуют, и звездочки, если они присутствуют среди мутаций, идентифицированных в библиотеке случайных мутантов.

1. Уимберли, Б. Т., Бродерсен, Д. Э., Клемонс, В. М., младший, Морган-Уоррен, Р. Дж., Картер, А.П., Вонрейн, К., Хартч, Т. и Рамакришнан, В. (2000) Nature 407, 327–339.

2. Шлюенцен, Ф., Точиль, А., Заривач, Р., Хармс, Дж., Глюеман, М., Джанелл, Д., Башан, А., Бартельс, Х., Агмон, И., Франчески , F., et al. (2000) Ячейка 102, 615–623.

3. Ноллер, Х. Ф., Хоанг, Л. и Фредрик, К. (2005) FEBS Lett. 579, 855–858.

4. Матасова А.Б., Роднина М.В.И Wintermeyer, W. (2001) РНК 7, 1879–1885.

5. Moine, H. & Dahlberg, A.E. (1994) J. Mol. Биол. 243, 402–412.

6. Полдерманс Б., Ван Буул К. П. и Ван Книппенберг П. Х. (1979) J. Biol. Chem . 254 , 9090–9093.

7. Триман К. Л. и Адамс Б. Дж. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 188–191.

Рис. 6. Кластер вредоносных мутаций в сайте 16S рРНК, включающий элементы спиралей 5 и 15.Позиции окрашены в соответствии со схемой, использованной на рис. 1. ( A ) Схема остова 16S рРНК. ( B ) Модель для заполнения пространства T. thermophilus 30S субъединицы (1), показывающая 16S рРНК светло-серым цветом и рибосомные белки темно-серым цветом.

1. Wimberly, BT, Brodersen, DE, Clemons, WM, Jr., Morgan-Warren, RJ, Carter, AP, Vonrhein, C., Hartsch, T. & Ramakrishnan, V. (2000) Nature 407, 327–339.

Рис.7. Кластер вредных мутаций в спирали 24. Позиции окрашены в соответствии со схемой, использованной на рис. 1. ( A ) Схема остова 16S рРНК. ( B ) Модель для заполнения пространства T. thermophilus 30S субъединицы (1), показывающая 16S рРНК светло-серым цветом и рибосомные белки темно-серым цветом.

1. Wimberly, BT, Brodersen, DE, Clemons, WM, Jr., Morgan-Warren, RJ, Carter, AP, Vonrhein, C., Hartsch, T. & Ramakrishnan, V. (2000) Nature 407, 327–339.

Рис. 8. Кластер вредных мутаций в сайте, включающем элементы спиралей 12 и 21. Позиции окрашены в соответствии со схемой, использованной на рис. 1. ( A ) Схема остова 16S рРНК . ( B ) Модель для заполнения пространства T. thermophilus 30S субъединицы (1), показывающая 16S рРНК светло-серым цветом и рибосомные белки темно-серым цветом.

Рис. 9. Кластер вредоносных мутаций в сайте, включающий элементы спиралей 35–37. Позиции окрашены в соответствии со схемой, использованной на рис. 1. ( A ) Схема остова 16S рРНК. ( B ) Модель T. thermophilus 30S-субъединицы (1), показывающая 16S рРНК в представлении, заполненном пространством, и рибосомные белки в представлении ленты.

1. Wimberly, BT, Brodersen, DE, Clemons, WM, Jr., Morgan-Warren, RJ, Carter, AP, Vonrhein, C., Hartsch, T. & Ramakrishnan, V. (2000) Nature 407, 327–339.

Supporting Movie 1

Movie 1. Доминантные вредные мутации в E. coli 16S рРНК, выбранной из случайной мутантной библиотеки. Позиции мутантов окрашены в соответствии с серьезностью фенотипа: красный, сильно вредоносный; синий, умеренно вредный; зеленый, умеренно вредный.В случае нуклеотидной делеции участка из нескольких идентичных нуклеотидов показано центральное положение участка. Мутации показаны в структуре рибосомной субъединицы Thermus aquaticus 30S (1).

1. Wimberly, BT, Brodersen, DE, Clemons, WM, Jr., Morgan-Warren, RJ, Carter, AP, Vonrhein, C., Hartsch, T. & Ramakrishnan, V. (2000) Nature 407, 327–339.

Таблица 1. Вредные мутации в E.coli 16S рРНК, выбранная из случайной мутантной библиотеки

Мутация	Домен	Спираль	Фенотип	Кол-во независимых клонов
C18G	5 ‘	2	Умеренный	1
U49C	5 ‘	5	мягкий	1
A51G	5 ‘	5	мягкий	4
A55G	5 ‘	5	Умеренный	1
G57A	5 ‘	5	мягкий	1
A161G	5 ‘	8	мягкий	1
G299A	5 ‘	12	мягкий	1
A373G	5 ‘	15	мягкий	1
A389G	5 ‘	15	мягкий	2
G506A	5 ‘	18	Умеренный	3
Y516G	5 ‘	18	Сильный	1
C518U	5 ‘	18	Сильный	4
C519U	5 ‘	18	Сильный	5
A520G	5 ‘	18	Сильный	10
G521A	5 ‘	18	Сильный	1
G527U	5 ‘	18	Умеренный	1
C528U	5 ‘	18	Умеренный	2
C536U	5 ‘	18	мягкий	1
G568C	Центральный	19	мягкий	1
ДА (607-609)	Центральный	21	мягкий	1
C614A	Центральный	21	мягкий	1
A622G	Центральный	21	мягкий	1
U684C	Центральный	23	мягкий	1
ДГ (773-776)	Центральный	24	Умеренный	2
A802G	Центральный	24	Умеренный	1
U804C	Центральный	24	Умеренный	1
G885A	Центральный	27	Умеренный	3
G963A	3 ‘мажор	31	Умеренный	1
A964G	3 ‘мажор	31	Умеренный	1
C972A / U	3 ‘мажор	31	Умеренный	2
G973A	3 ‘мажор	31	Сильный	1
A1014G	3 ‘мажор	33	мягкий	2
G1053A	3 ‘мажор	34	Умеренный	3
C1054U	3 ‘мажор	34	мягкий	3
A1055G	3 ‘мажор	34	мягкий	1
G1058A	3 ‘мажор	34	Сильный	7
G1068A	3 ‘мажор	35	Сильный	2
G1072A	3 ‘мажор	35	Умеренный	1
U1073C	3 ‘мажор	35	мягкий	1
U1085C	3 ‘мажор	37	мягкий	1
A1111U	3 ‘мажор	37	Сильный	1
G1181A	3 ‘мажор	40	Умеренный	1
C1200G	3 ‘мажор	34	Умеренный	1
C1208G	3 ‘мажор	34	Сильный	1
C1395U	3 ‘мажор	28	Сильный	1
U1406C	3 мин.	44	Сильный	3
A1410C	3 мин.	44	Умеренный	1
U1495C	3 мин.	44	Сильный	2
A1499G	3 мин.	44	Умеренный	1
A1502G	3 мин.	44	Умеренный	1
U1506A	3 мин.	45	Умеренный	1
ДГ (1514-1517)	3 мин.	45	Сильный	1
A1534G	3 мин.	45	Умеренный	1

Вспомогательные материалы и методы

Обогащение сегментно-мутантных библиотек в клонах с вредоносным фенотипом. Клетки сегментно-мутантных библиотек выращивали в течение ночи при 30 ° C в среде LB, содержащей 100 мг / мл ампициллина, и на следующее утро их разбавляли 1: 200 в 200 мл свежего LB / ампициллина. Через 2 часа роста при 30 ° C температуру повышали до 42 ° C и культуры выращивали еще в течение часа. Эритромицин добавляли до конечной концентрации 7,34 мг / л (10 мМ). Через 3,5 часа при 42 ° C культуры разбавляли свежей средой LB / ампициллин / эритромицин до A ₆₀₀ 0,1 и добавляли циклосерин до 30.6 мг / литр. Культуры выращивали в присутствии циклосерина в течение 2 ч. Клетки осаждали, промывали один раз 20 мл LB / ампициллина, ресуспендировали в 50 мл LB / ампициллина и выращивали в течение ночи при 30 ° C. Получили полную плазмиду и использовали для трансформации свежих клеток POP2136. Трансформанты высевали на чашки с LB / ампициллин / агаром. Планшеты выращивали в течение ночи при 30 ° C, и отдельные колонии инокулировали в 90 мл среды LB / ампициллин в лунки 384-луночных микротитровальных планшетов с использованием автоматического устройства для сбора колоний (Biorobotics, Genomic Solutions, Ann Arbor, MI).

Анализ b-галактозидазы. Клетки KLF10, трансформированные плазмидой pKF207, несущей вредные мутации в гене 16S рРНК, выращивали в течение ночи в бульоне LB / ампициллин, содержащем 15 мМ L-арабинозу и 0,5 мМ IPTG. Клетки из 10 мл культур осаждали, промывали буфером Z (61 мМ Na ₂ PO ₄, 39 мМ NaH ₂ PO ₄, 10 мМ KCl и 10 мМ MgSO ₄). хранили при –20 ° C в течение 1 ч, а затем ресуспендировали в 1 мл буфера Z.Затем 120 мл клеточной суспензии лизировали 120 мл реагента для экстракции клеток B-PER (Pierce). Затем 200 мл лизата объединяли с 800 мл буфера Z, содержащего 400 нМ дитиотрейтола и 200 мл 4 мг / мл ONPG ( o -нитрофенил-b-D-галактопиранозид). Образцы инкубировали при комнатной температуре до появления видимого желтого цвета. Реакции останавливали добавлением 0,5 мл 1 М Na ₂ CO ₃. Поглощение при 420 нм и 600 нм измеряли на спектрофотометре UV160U (Shimadzu), а активность (единицы Миллера) рассчитывали следующим образом: 1000 ´ (A ₄₂₀) / ( T ´ A ₆₀₀ × 0.1), где T — время в минутах.

Полисомный анализ. E. coli Клетки POP2316, трансформированные мутантными плазмидами pLK45, выращивали в течение ночи при 30 ° C в LB / Amp. Пятьдесят микролитров ночной культуры разводили в 100 мл LB / ампициллина и выращивали в течение 2 ч при 30 ° C. Температуру повысили до 42 ° C, рост продолжался 3–4 ч. Когда плотность культур достигала A ₆₀₀ 0,4–0,7, добавляли 125 мл раствора хлорамфеникола 100 мг / мл.Через 3–4 мин клетки осаждали в холодном роторе JA-25 (Beckman; 8000 об / мин в течение 10 мин). Осадки клеток суспендировали в 500 мл охлажденного буфера для лизиса (20 мМ Трис · HCl, pH 7,5 / 15 мМ MgCl ₂). Добавляли пятьдесят микролитров свежеприготовленного раствора лизоцима 10 мг / мл и клетки замораживали на бане сухой лед / этанол. Клетки размораживали на бане с ледяной водой, повторно замораживали и хранили при -70 ° C до тех пор, пока не было удобно проводить полисомный анализ. Для анализа профиля полисома в градиенте сахарозы клетки размораживали на бане с ледяной водой и добавляли 15 мл 10% дезоксихолата натрия для завершения лизиса.Лизаты центрифугировали при 4 ° C при 20 000 ´ g в течение 15 мин, и 20–22 A ₂₆₀ загружали в 11 мл 10–40% градиента сахарозы в буфере (20 мМ Трис · HCl, pH 7,5. / 10 мМ MgCl ₂/100 мМ NH ₄ Cl ₂/2 мМ BME). Градиенты центрифугировали в роторе SW-41 при 39000 об / мин при 4 ° C. Время центрифугирования варьировалось от 2 ч 40 мин до 10 ч, в зависимости от желаемой степени разделения рибосомных субъединиц и пиков полисом. Градиенты сахарозы фракционировали, используя градиентный фракционер (Brandel), и оптическую плотность контролировали при 254 нм, используя детектор оптической плотности ISCO UA-6.Наконец, фракции по 0,375 мл собирались, когда фракционированный материал требовался для дальнейшего анализа.

(PDF) Дисперсия и экологическое воздействие инвазивных пресноводных двустворчатых моллюсков Limnoperna fortunei в водоразделе Рио-де-ла-Плата и за его пределами

Клауди Р. и Макки Г.Л. (1994) Практическое руководство для Zebra

Мониторинг и контроль мидий. CRC Press, Boca Raton

Clemente JM and Brugnoli E (2000) Primer registro de

Limnoperna fortunei (Dunker 1857) en el Rı

o Negro

(Embalse Palmar) y Rı

.Tercer Seminario sobre la

Calidad de las Aguas Contaminadas, Colo

n, Entre Rı

os,

Аргентина, 29–30 ноября 2000 г.

Darrigran G (2002) Потенциальное воздействие фильтра- кормление захватчиков

во внутренних пресноводных средах умеренного климата. Биологические

Вторжения 4: 145–156

Darrigran G, Martin SM, Gullo B и Armendariz L (1998)

Макробеспозвоночные, связанные с Limnoperna fortunei

(Dunker, 1857) (Bivalvia, Mytilidae) в Rı

o de la Plata,

Аргентина.Hydrobiologia 367: 223–230

Депетрис П.Дж. и Кемпе С. (1993) Динамика углерода и источники

в реке Парана

. Лимнолги и океанография 38: 382–395

Элтон К.С. (1958) Экология вторжений животных и

растений. Methuen, London

Ferriz RA, Villar CA, Colautti D and Bonetto C (2000)

Alimentacio

ndePterodoras granulosus (Valenciennes)

(Рыбы, Doradidae) en la baja Muse cuenca del Plata 9000 Argentino de Ciencias Naturales ‘Bernardino

Rivadavia’, Новая серия.Hydrobiologia 2: 151–156

Furch K и Junk WJ (1997) Физико-химические условия в поймах рек

. В: Junk WJ (eds) The Central Amazon

oodplain. Экология импульсной системы, стр 69–108.

Springer – Verlag, Berlin

Garton DW and Haag WR (1993) Сезонные репродуктивные циклы

и модели расселения Dreissena polymorpha на западе

озера Эри. В: Nalepa TF и Schloesser DW (ред.) Zebra

Мидии: биология, воздействие и контроль, стр 111–128.Lewis

Publishers, Boca Raton

Griths RW, Schloesser DW, Leach JH and Kovalak WP

(1991) Распространение и распространение Zebra Mussel

(Dreissena polymorpha) в районе Великих озер. Канадский

Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 48: 1381–1388

Guerrero RA, Lasta C, Acha M, Mianzan H and Framin

an M

(1997) Atlas Hidrogra

co del Rı

o de la Plata.Comisio

Administradora del Rı

o de la Plata, Buenos Aires

Hamilton SK и Lewis WM (1990) Морфология бассейна в

в связи с химическими и экологическими характеристиками озер на

пойма реки Ориноко, Венесуэла. Archiv fu

r Hydro-

biologie 119: 393–425

Iwaskiw JM (2001) Pesquerı

as continentales del tramo

argentino de la Cuenca del Plata.Consejo Federal de

Inversiones, Аргентина

Junk WJ (1997) Общие аспекты экологии пойменных водоемов со специальным справочником

о поймах Амазонки. В: Junk WJ

(ред.) Центральная пойма Амазонки. Экология импульсной системы

, стр. 3–22. Springer – Verlag, Berlin

Junk WJ и Робертсон Б.А. (1997) Водные беспозвоночные. В:

Junk WJ (ред.) Центральная пойма Амазонки. Экология

Импульсная система, стр. 279–298.Springer – Verlag, Берлин,

Каратаев А.Ю., Бурлакова Л.Е. и Падилла Д.К. (1997) Последствия вторжения Dreissena polymorpha (Pallas)

на сообщества

четвертичных

в Восточной Европе. Journal of Shellfsh

Research 16: 187–203

Каратаев А.Ю., Бурлакова Л.Е. и Падилла Д.К. (1998) Physical

факторов, ограничивающих распространение и численность

Dreissena polymorpha (Pall.). Journal of Shellfsh Research

17: 1219–1235

MacIsaac HJ, Grigorovich IA и Ricciardi A (2001) Reas-

оценка концепций инвазий видов: бассейн Великих озер

в качестве модели.Biological Invasions 3: 405–416

Maglianesi RE (1973) Principales caracterı

sticas quı

micas y

fı

sicas del las aguas

sicas del las aguas del 9000 y Paraguay Inferior.

Physis 32: 185–197

Mansur MCD, Richinitti LMZ и dos Santos CP (1999)

Limnoperna fortunei (Dunker, 1857), двустворчатый захватчик молуско

na bacia do Guaı

ba, Rio

Сул, Бразилия.Biocieˆ ncias

7: 147–149

Mansur MCD, dos Santos CP, Darrigran G, Heydrich I, Callil

CT и Cardoso FR (2003) Primeiros dados quali-quanti-

tativos do mexilha

o-dourado, Limnoperna fortunei (Dun-

ker), no Delta do Jacuı

, no Lago Guaı

ba e na Laguna dos

Patos, Rio Grande do Sul, Brasil e algunsos de sua

invasa

o novo ambiente.Revista Brasileira de Zoologia

20: 75–84

McNeill DB (2001) Биология и потенциальные воздействия Limno-

perna fortunei (Дункер). Дрейссена! Дайджест

Национального центра обмена информацией о вредных водных видах 11: 1–9

Montalto L, Oliveros OB, Ezcurrade Drago I and Demonte LD

(1999) Peces del Rı

o Parana

medio predadores de una

Особи инвазора: Limnoperna fortunei (Bivalvia, Mytilidae).

Revista de la Facultad de Bioquı

mica y Ciencias Biolo

gicas

de la Universidad Nacional del Litoral 3: 85–101

Morton BS (1979) Пресноводные двустворчатые моллюски. Труды

Первого международного симпозиума Corbicula. Техас

Христианский университет, Форт-Уэрт, Техас

О’Фаррелл I (1994) Сравнительный анализ фитопланктона

пятнадцати низинных флювиальных систем бассейна Ривел-Плейт

(Аргентина).Hydrobiologia 289: 109–117

Огава К., Накацугава Т. и Ясудзаки И.М. (2004) Тяжелые

метацеркариальные инфекции карповых рыб в реке Удзи.

Fisheries Science 70: 132–140

Padilla DK, Chotkowski MA и Buchan LAJ (1996) Предсказывают

распространение мидий-зебр (Dreissena polymorpha) во внутренних водах

с использованием моделей движения лодочников. Global

Ecology and Biogeography Letters 5: 353–359

Pastorino G, Darrigran G, Martin S и Lunaschi L (1993)

Limnoperna fortunei (Dunker, 1957) (Mytilidae) nuevo biv-

alvo invasor en aguas del Rı

o de la Plata.Neotropica 39: 101

Payne AI (1986) Экология тропических озер и рек. Wiley,

Chichester

Penchaszadeh PE, Darrigran G, Angulo C, Averbuj A,

Brogger M, Dogliotti A and Pirez N (2000) Поимка

инвазивных пресноводных мидий Limnoperna fortunei (Dunker 1857

). Mytilidae) рыбой Leporinus obtusidens Valenci-

ennes, 1846 (Anostomidae) в Рио-де-ла-Плата, Аргентина.

Journal of Shellfsh Research 19: 229–231

Пиментел Д., Лач Л., Зунига Р. и Моррисон Д. (2000)

Экологические и экономические издержки некоренных видов

в США.Bioscience 50: 53–65

Поддубный А.Г. (1966) Адаптивная реакция Rutilus rutilus на

изменчивые условия окружающей среды. Труды Института Биологии

Внутренних вод Академии Наук СССР 10: 131–138

Рамчаран К.В., Падилла Д.К. и Додсон С.И. (1992) Модели до

предсказывают потенциальное появление и плотность Zebra

962

Запасной кран Danze 9

Ищете такой сложно найти сменный картридж для красивого смесителя Danze? У нас это есть! Запасные части и картриджи для ваших продуктов Danze можно найти прямо здесь.Не знаете, какой картридж вам нужен? Не переживайте! У ваших друзей на PlumbingSupply.com® есть для вас удобный справочник, в том числе помощь в поиске номера вашей модели.

Есть номер детали? Уже знаете, что вам нужно? Начните здесь.

Если вы не уверены, какой картридж вам нужен, щелкните по ссылкам ниже, чтобы просмотреть модели смесителей Danze и найти свой номер детали.

С 2010 года Danze помещает на смесители этикетку, чтобы помочь идентифицировать продукт после установки. Ищите метки на нижней стороне кожуха ручки, прикрепленного к подающему шлангу, прикрепленного к клапанам внутри стены или за рамкой клапана на клапанах внутри стены.

Картриджи Danze для смесителей для кухни, ванной и ванны / душа

Установленные позиции возврату не подлежат. Перед заказом сравните фотографии (если таковые имеются) и номера деталей с имеющимся у вас картриджем, чтобы убедиться, что вы получаете нужный элемент!

Доставка деталей для смесителей

Danze в настоящее время занимает 5-7 рабочих дней.

Клапаны для ванны и душа

Обратите внимание, что клапаны и трим Danze часто взаимозаменяемы.Например, с комплектом только для душа Danze у вас может быть клапан D112000BT с упорами или клапан D115000BT без упоров. В большинстве комбинаций ванны и душа используется клапан D113000BT, но в некоторых вместо него используется термостатический клапан. Перед заказом внимательно сравните имеющийся картридж с изображениями (если таковые имеются).

Клапан	Номера моделей и картридж
	D112000BT — однопортовый клапан выравнивания давления с упором для отвертки Использует картридж DA507107
	D112010BT — однопортовый клапан выравнивания давления с упором для отвертки Использует картридж DA507107
	D113000BT — клапан баланса давления с переключателем и упором для отвертки Используется картридж DA507107
	D113010BT — клапан баланса давления с переключателем и упором для отвертки Используется картридж DA507107
	D115000BT — однопортовый клапан выравнивания давления БЕЗ упоров для отвертки Использует картридж DA507108

Клапан	Номера моделей и картридж
	D115010BT — однопортовый клапан выравнивания давления БЕЗ упоров для отвертки Использует картридж DA507108
	D130000BT — 4-ходовой трехпозиционный переключающий клапан Использует картридж DA507850
	D130505BT — 3-ходовой двухпозиционный переключающий клапан Использует картридж DA507923
	D135300BT — клапан регулировки объема Использует картридж DA507933
	D151000BT — термостатический клапан с двумя ручками и регулятором объема Термокартридж DA507874 Картридж объема DA507875

Клапан	Номера моделей и картридж
	D155000BT — термостатический клапан с одной ручкой БЕЗ регулятора объема Использует картридж DA507874
	D210000BT — фиксированный 10-дюймовый римский заправочный клапан ванны ХОЛОДНЫЙ картридж DA507174 ГОРЯЧИЙ картридж DA507173
	D210100BT — фиксированный римский наполнитель для ванн объемом 10 дюймов с клапаном ручного душа Картридж ХОЛОДНЫЙ DA663473 Картридж ГОРЯЧИЙ DA663472
	D215000BT — римский клапан для наполнения ванны регулируемой ширины ХОЛОДНЫЙ картридж DA507174 ГОРЯЧИЙ картридж DA507173
	D215500BT — римский наполнитель для ванны регулируемой ширины с клапаном ручного душа ХОЛОДНЫЙ картридж DA663473 ГОРЯЧИЙ картридж DA663472